Molekulare Biotechnologie Ruprecht-Karls-Universität Heidelberg Jan-Philipp Stier Marc Matuszewska Wendelin Wolf Lars Lüdicke Thomas Horn Molekulare Biotechnologie Ruprecht-Karls-Universität Heidelberg Stier/Matuszewska/Wolf/Lüdicke/Horn

Stier/Matuszewska/Wolf/Lüdicke/Horn Gliederung Begriff und Geschichte der PCR Ablauf der PCR allgemein Mathematische Beschreibung der PCR mathematische Problemstellungen der PCR Quantitative PCR RT-PCR Real Time PCR Beispiele Stier/Matuszewska/Wolf/Lüdicke/Horn

Stier/Matuszewska/Wolf/Lüdicke/Horn I. Begriff und Geschichte PCR (Polymerase Chain Reaction) „Polymerase-Kettenreaktion“ zur Vervielfältigung von Nukleinsäuren Erfinder: Kary Mullis (1985) PCR eröffnet in fast allen Bereichen der Naturwissenschaft zahlreiche neue Möglichkeiten Nobelpreis für Mullis 1993 Stier/Matuszewska/Wolf/Lüdicke/Horn

Stier/Matuszewska/Wolf/Lüdicke/Horn II. Ablauf der PCR allgemein I Benötigte Reagenzien (Master Mix) Nukleotide (dNTP): dATP, dGTP, dTTP, dCTP Taq DNA-Polymerase: Enzym repliziert DNA Enzym-Cofaktor: Mg2+ Enzym, welches Kontaminationen abbaut Puffer: Erhaltung pH-Wert, Salzkonzentration spezifische Primer (20-30 Basen: sense-, antisense) zu amplifizierende DNA Stier/Matuszewska/Wolf/Lüdicke/Horn

Stier/Matuszewska/Wolf/Lüdicke/Horn II. Ablauf der PCR allgemein II PCR ist 3-Schritt-Prozess (Zyklus) 1. Denaturierung (T>90°C): ein dsDNA Molekül in zwei ssDNA Moleküle 2. Annealing (Anlagerung: 40°C<T<65°C): Bindung spezifischer Primer an Zielsequenz 3. Extension (Verlängerung: T≈72°C): Synthese (5‘-3‘) zwei ssDNA zu zwei dsDNA Stier/Matuszewska/Wolf/Lüdicke/Horn

zu vermehrender DNA-Abschnitt 5’ 3’ Denaturierung (T>90°C) 5’ 3’ Annealing (40 – 65 °C) 3’ 5’ DNA-Synthese (72 °C) 5’ 3’

PCR-Gerät Schutzhaube Heizblöcke Steuerungseinheit

III. Mathematische Beschreibung der PCR I Zyklus 1 Zyklus 2 Zyklus 3 Zyklus 4 1 Denaturierung 2 Annealing 3 Extension N = N0 * 2n N N N = Zahl der amplifizierten Moleküle N0 = Zahl der Startmoleküle n = Zahl der Zyklen N n N

Stier/Matuszewska/Wolf/Lüdicke/Horn III. Mathematische Beschreibung der PCR II theoretisch: 20 Zyklen: 1,048,576 30 Zyklen: 1,073,741,824 N N N n N Plateau-Phase Limitierung von Reaktionskomponenten Thermische Inaktivierung der DNA Polymerase Reassoziation der PCR-Produkte konkurriert mit Primeranlagerung Stier/Matuszewska/Wolf/Lüdicke/Horn

Stier/Matuszewska/Wolf/Lüdicke/Horn III. Mathematische Beschreibung der PCR III Effizienz E der PCR: Anteil der Matrizen (Templates), die in jedem Schritt umgesetzt wird ≠ 100% E meist um die 85% geringe Veränderungen E  große Veränderungen N Beispiel: E=0.85; n=30 => N=10.4*107N0 E=0.80; n=30 => N= 4.6*107N0 N = N0 * (1+E)n E = Amplifikationseffizienz Stier/Matuszewska/Wolf/Lüdicke/Horn

Stier/Matuszewska/Wolf/Lüdicke/Horn IV. Mathematische Problemstellungen I Primer Schmelztemperatur Einfaches Modell Primer kürzer als 14 Nukleotide: TM=2*(A+T)+4*(G+C) Primer länger als 14 Nukleotide: TM=64.9+(G+C-16.4)/(A+T+C+G) entscheidend ist der GC Gehalt (3 H-Bindungen), beeinflusst TM maßgeblich Stier/Matuszewska/Wolf/Lüdicke/Horn

Stier/Matuszewska/Wolf/Lüdicke/Horn IV. Mathematische Problemstellungen II Kompliziertes Modell R… molare Gaskonstante R=1.987(cal/°C*mol) g… dimensionslose molare Primerkonzentration g=50*10-9 T0=-273.15°C t… Temperaturkurrektor t=-21,6°C DS… Entropie des Primers in cal/(K*mol) DH… Enthalpie des Primers in kcal/mol Stier/Matuszewska/Wolf/Lüdicke/Horn

Stier/Matuszewska/Wolf/Lüdicke/Horn IV. Mathematische Problemstellungen III Berechnung Enthalpie, Entropie: DH(p)=i=1Sn-1DH(pi,pi+1); DS äquivalent Beispiel: p=GGAT DH(GGAT)=DH(GG) +DH(GA)+DH(AT) (pi;pi+1) DH(pi;pi+1) DS(pi;pi+1) AA oder TT 9.1 24.0 AT 8.6. 23.9 TA 6.0 16.9 CA oder TG 5.8 12.9 GT oder AC 6.5 17.3 CT oder AG 7.8 20.8 GA oder TC 5.6 13.5 CG 11.9 27.8 GC 11.1 26.7 GG o. CC 11.0 26.6 Stier/Matuszewska/Wolf/Lüdicke/Horn

Stier/Matuszewska/Wolf/Lüdicke/Horn V. Quantitative PCR I Frage: Wie groß ist N0? Methode 1: Titrationsanalyse Verwendung externen Standards mit bekanntem N0 Anfertigung Verdünnungsreihe von Standard und Probe Amplifikation in n Zyklen Berechnung N0 Probe über Steigung Stier/Matuszewska/Wolf/Lüdicke/Horn

Stier/Matuszewska/Wolf/Lüdicke/Horn V. Quantitative PCR II Auswertung: der Unterschied von N0 ist proportional zu den Steigungen der Geraden man sucht Wert auf x-Achse (linearer Teil) Abtragung der dazu gehörigen y-Werte Differenz dieser Werte gleich der Differenz von N0 von Probe und Standard so etwa 2- bis 10-fache Konzentrationsunterschiede bestimmbar Probe Standard Log N Log N0 Stier/Matuszewska/Wolf/Lüdicke/Horn

Stier/Matuszewska/Wolf/Lüdicke/Horn V. Quantitative PCR III einfaches Beispiel: N0S=100 (log N0S=2), n=20, E=0.85 => NS=100*(1+0.85)20 NS=2.21*107 => log NS=7.344 NP bei N0=100 => log NP=7.568 log N0S + 0.224 ergibt log N0P log N0P=2.224 N0P=168 Probe Log N Standard 7.568 7.344 2 Log N0 Stier/Matuszewska/Wolf/Lüdicke/Horn

Stier/Matuszewska/Wolf/Lüdicke/Horn V. Quantitative PCR III Methode 2: lineare Analyse N = N0 * (1+E)n Log N = [Log (1+E)]*n + Log N0 (nach: Y = a * X + b) Log (1+E) Log N Log N n Stier/Matuszewska/Wolf/Lüdicke/Horn

VI. Reverse Transcriptase oder RT-PCR Ausgangsmaterial: m-RNA ds-cDNA Enzym: Reverse Transcriptase Retroviren Mangan-Ionen Tth-Polymerase Reverse Transcriptase Stier/Matuszewska/Wolf/Lüdicke/Horn

3’ 5’ mRNA 3’ 5’ Primer 1 Reverse Transkription 5’ 3’ einzelsträngige cDNA Primer 2 5’ 3’ Synthese des komplementären cDNA Stranges doppelsträngige 3’ 5’ cDNA Amplifikation Primer 1 3’ 5’ 3’ 5’ Primer 2 5’ 3’

In diesem Zustand Detektion möglich VII. Real Time PCR Im Prinzip wie eine Standard PCR, jedoch mit Farbstoff der in die DNA interkaliert In diesem Zustand Detektion möglich früher: Ethidiumbromid und Detektion mit Videokamera heute: Fluoreszierende Farbstoffe und digitale Aufnahme Echtzeitmessung mit jedem Zyklus Stier/Matuszewska/Wolf/Lüdicke/Horn

Stier/Matuszewska/Wolf/Lüdicke/Horn Fluoreszenz Zyklenzahl Stier/Matuszewska/Wolf/Lüdicke/Horn

VIII. Messung von Metallothionein-I mRNA Auswertung Auftragen der Werte in ein Diagramm: x-Achse = log(Std.DNA) y-Achse = log(Verhältnis) Geradengleichung: Schnittpunkt mit der x-Achse ist Äquivalenzpunkt (log1=0) Stier/Matuszewska/Wolf/Lüdicke/Horn

VIII. Gen-Expression durch RT-PCR CT-Wert Patientenabhängig Errechnet sich aus den Zyklen, die benötigt werden, um einen spezifischen Schwellenwert zu überschreiten ( Fluoreszenz) Normierung des CT-Wertes des Target-Gens Eichung des CT(Target)-Wertes zu Bezugsexpressionsgröße 2 -∆∆CT relative Expression in Bezug auf Calibrator-Gen (100%) Stier/Matuszewska/Wolf/Lüdicke/Horn

Stier/Matuszewska/Wolf/Lüdicke/Horn Vielen Dank für eure Aufmerksamkeit Vielen Dank für eure Aufmerksamkeit Vielen Dank für eure Aufmerksamkeit Vielen Dank für eure Aufmerksamkeit Stier/Matuszewska/Wolf/Lüdicke/Horn