Praktikum Molekularbiologie

Präsentation zum Thema: "Praktikum Molekularbiologie"—  Präsentation transkript:

1 Praktikum Molekularbiologie
Klonierungsvektor DNA-Sequenzierung: Sanger DNA-Sequenzierung: next generation

2 Klonierungsvektor

3 Ligation PCR-Produkt Re-Ligation des Vektors Plasmid-Vektor Ligase
(zukünftiges Insert) Re-Ligation des Vektors Plasmid-Vektor (pDrive, Qiagen; pBluescript, Stratagene; pGEM, Promega) Ligase Zirkuläres PCR-Produkt Vektor + Insert

4 Transformation +   E. coli Transformation Wachstum auf LB-AXI ?
PCR-Produkt Plasmid + E. coli Transformation Wachstum auf LB-AXI ? ? ? ? ? - -  

5 pDrive Klonierungsstelle

6 Blau/Weiß Selektion Klonierungsstelle pDrive oder pBluescript lacZ‘
Ligation Genexpression β -Galacxtosidase Etwas aktiv: hellblau β-Galactosidase β -GalacXXXtosidase Aktiv: blau Inaktiv: weiß

7 Transformation +   Transformation E. coli Wachstum auf LB-AXI ? - -
blau weiß

8 Insert-Analyse spezifisch universell blau weiß blau weiß

9

10 DNA-Sequenzierung DNA-Polymerase Sanger-Methode Next Generation
Detektion Next Generation

11 PCR vs. Sequencing Reagenzien PCR DNA-Matrize dNTP (A,C,G,T)
Primer forward Primer reverse PCR-Puffer Taq-Polymerase Reagenzien Sequencing DNA-Matrize dNTP (A,C,G,T) ddNTP ein Primer Sequencing-Puffer mod. Taq-Polymerase Zwei Matrizenstränge Exponentielle Zunahme Produkt mit bestimmter Größe dsDNA Ein Matrizenstrang Lineare Zunahme Produkte unterschiedlicher Größe ssDNA

12 Didesoxynukleotide Aciclovir

13 Polyacrlyamidgelelektrophorese
Produkte unterschiedlicher Größe ssDNA PAGE: Trennung nach Größe mit hoher Auflösung!

14 DNA-Polymerase Domänen
5‘-3‘ Exonuklease 3‘-5‘ Exonuklease 5‘-3‘ Polymerase E. coli Pol I 928 As

15 DNA-Polymerase Herausschneiden von ddNTPs

16 Produkte unterschiedlicher Größe ssDNA
Produkte unterschiedlicher Größe ssDNA Produkte unterschiedlicher Größe ssDNA Verkürzen von Fragmenten früherer Zyklen

17 DNA-Polymerase Domänen
5‘-3‘ Exonuklease 3‘-5‘ Exonuklease 5‘-3‘ Polymerase E. coli Pol I 928 As  dNTP Bindetasche Taq Pol 832 As   Thermo Sequenase 560 As F667Y  Erleichterter Einbau ddNTPs Tabor & Richardson (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA (92),

18 DNA-Polymerase Taq-DNA-Polymerase... ...modifiziert
Ohne 3‘-5‘ Exonuklease Ohne 5‘-3‘ Exonuklease Mod. dNTP Bindetasche Keine „Reparatur“ der ddNTP Keine unerwünschten Fragment- längen Verringerte ddNTP Diskriminierung

19 Detektion... ... ist ein Problem, weil ausgehend von nur einem Primer
nur lineare Amplifikation möglich!  geringe Produktmengen

20 Detektion - radioaktiv
Radioaktive Markierung von dATP 33P, 32P 35S

21 Detektion - Floureszenz
Fluoreszenz Markierung Fam (494nm, 517nm) Hex (535nm, 553nm) Rox (587nm, 607nm)

22 Detektion – Markierung
Welche Moleküle können markiert werden? Primer am 5‘-Ende dNTPs ddNTPs ddNTPs mit vier verschiedenen Farben (Fluoreszenz)

23 http://www. mcb. uct. ac. za/principles%20of%20DNA%20sequencing/sld033

24 http://www. mcb. uct. ac. za/principles%20of%20DNA%20sequencing/sld033

25 http://www. mcb. uct. ac. za/principles%20of%20DNA%20sequencing/sld033

26 pDrive Klonierungsstelle Orientierung: Spez. Primer f oder r?

27

28 Next Generation Sequencing
Jay Shendure & Hanlee Ji (2008) Next-generation DNA sequencing, Nature Biotechnology 26 (10), Elaine R. Mardis (2008) Next-Generation DNA Sequencing Methods, Annual Review of Genomics and Human Genetics 9:387–402

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30 Denaturieren + Annealing Elongation Bridge PCR

31 Emulsion PCR

32 454 Platform Pyrosequencing

33 APS = Adenosinphosphosulfat
Gharizadeh, B. et al. Typing of Human Papillomavirus by Pyrosequencing. Lab Invest 2001, 81:673–679

34 Gharizadeh, B. et al. Typing of Human Papillomavirus by Pyrosequencing
Gharizadeh, B. et al. Typing of Human Papillomavirus by Pyrosequencing. Lab Invest 2001, 81:673–679

35 Fertiges Genom als Gerüst!
Assembly schwierig Hohe Fehlerrate Assembly einfach Geringe Fehlerrate Fertiges Genom als Gerüst! De Novo Sequenzierung Sanger cloning Polymerase ~$ $200, bp

36 Take Home Sanger: Kettenabbruch Polymerase: modifiziert
Detektion: Fluoreszenz Next Generation: Genome