Die DNA-Replikation erfolgt bi-direktional

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1 Die DNA-Replikation erfolgt bi-direktional
Replikationsgabel DNA-Polymerasen starten die Replikation am Replikations-Startpunkt = “Origin“

2 Wie funktioniert der einzige “Origin of Replication“ in E. coli?
OriC DnaA (ATPase) Startkomplex 30°C DnaB = Helikase DnaC ATP Erkennung Offener Komplex leichtes „Schmelzen“ der DNA „Prä-Priming“ Komplex - Primase - DNA-Polymerase Replikation

3 entlang der Basenpaare
Der Mechanismus der DNA-Replikation ori Brechen der H-Brücken ( Helicase) entlang der Basenpaare

4 Wie werden die Desoxy-Nukleotid-Bausteine in die DNA eingebaut?
5‘ 3‘ Die Biochemie der DNA-Kettenverlängerung Wie werden die Desoxy-Nukleotid-Bausteine in die DNA eingebaut? allgemein gilt: Desoxynukleosid-5‘-Triphosphate sind die aktivierten Vorstufen bei der DNA-Synthese: dATP, dCTP, dGTP, dTTP (dNMP) n + dNTP (dNTP) n+1+ PPi DNA-Polymerase Neu-eintretendes Desoxy-Nukleosid-Triphosphat 5‘ 3‘ o 5‘ > 3‘ Verknüpfung (Phospho-Diester-Brücken) o 5‘-Ende mit Phosphat-Gruppe o 3‘-Ende mit freier OH-Gruppe O Nukleophiler Angriff der 3‘-OH Gruppe am a-Phosphoatom +

5 Die Biochemie der DNA-Kettenverlängerung
Wie werden die Desoxy-Nukleotid-Bausteine in die DNA eingebaut?

6 Die Biochemie der DNA-Replikation
(dNMP)n + dNTP (dNMP)n+1+ PPi DNA-Polymerase grundsätzlich gilt, daß DNA-Polymerasen nur synthetisieren können 5‘>3‘ d. h . DNA-Polymerasen besitzen eine 5‘>3‘ Polymerase-Aktivität 3‘ DNA-Polymerase Bewegung der Replikationsgabel 5‘ 3‘ DNA-Polymerase 5‘ 3‘ 5‘

7 Das Problem der “lagging strand“ DNA-Replikation dis-kontinuierlicher
DNA-Polymerasen besitzen eine 5‘>3‘ Polymerase-Aktivität DNA-Polymerase kontinuierlicher Strang (“leading strand“) 3‘ 3‘ Bewegung der Replikationsgabel 5‘ 3‘ 5‘ 3‘ 5‘ dis-kontinuierlicher Strang (“lagging strand“) 5‘

8 Noch ein anderes Problem bei der DNA-Replikation......

9 damit die DNA-Polymerase den 2. Strang auffüllen kann
DNA-Polymerasen benötigen einen kurzen “RNA-Primer“ zum Start der Replikation Primer DNA-Polymerase DNA-Polymerasen verwenden den einzelsträngigne DNA-Strang als Matritze, aber der Einzelstrang muß einen Primer gebunden haben (doppelsträngiger Abschnitt), damit die DNA-Polymerase den 2. Strang auffüllen kann

10 DNA-Polymerasen benötigen einen kurzen “RNA-Primer“ zum Start der Replikation
leading strand 3‘ 3‘ 3‘ 5‘ Primer 5‘ 5‘ 3‘ lagging strand 5‘

11 Die vollständige Synthese des Folgestrangs
Primer Okazaki Fragment Primer

12 Die Ligase-Reaktion DNA-Ligase + ATP + PPi

13 Die einzelnen Schritte der Ligase-Reaktion
e-Aminogruppe eines Lysins ATP PPi Enzym-AMP AMP

14 Vergleich der drei DNA-Polymerasen von E. coli
DNA-Reparatur DNA-Reparatur DNA-Replikation Anzahl der Untereinheiten Synthese-Rate (Nukleotide/sec) Prozessivität (eingefügte Nukleotide vor dem Abdissoziieren) 3‘>5‘ Exonuclease (Korrekturlesen) ja ja ja 5‘>3‘ Exonuclease ja nein nein Molekulargewicht 103 kDa 88 kDa 900 kDa

15 Untereinheiten und Struktur der DNA-Polymerase III von E. coli
vermutlich Schleifenbildung b-Untereinheit für die Bindung an die DNA e-Untereinheit 3‘>5‘ Exonuclease a-Untereinheit mit DNA-Polymerase- Aktivität (5‘>3‘) Die DNA-Polymerase III (Holoenzym) bildet einen Dimer und kann dadurch gleichzeitig sowohl am Leitstrang wie am Folgestrang synthetisieren. Die Synthesegeschwindigkeit beträgt: V = 1000 BP/sec

16 „Akzessorische Proteine“ der DNA-Polymerase
Klammer Griff Der Griff-Klammer-Komplex (RFC-PCNA) kann armreifartig an der DNA entlanggleiten. An den Griff-Klammer-Komplex bindet die DNA-Polymerase III, die während der Replikation dadurch mit hoher Prozessivität an der DNA entlangwandern kann, ohne dabei abzufallen DNA-Polymerase III DNA Kristallstruktur von Klammer-Dimer Komplex

17 Das E. coli Replisom mit seinen verschiedenen Komponenten
Damit die DNA-Replikation in der Replikationsgabel kontinuierlich voran- schreiten kann, muß die doppelsträngigeDNA in der Gabel in die Einzelstränge getrennt werden. >> Eine DNA-Helicase windet unter ATP-Verbrauch die DNA auf. Bewegungsrichtung der Replikationsgabel Helicase Damit die entwundene DNA kurzzeitig einzelsträngig bleibt, bindet das SSB (“single-stranded DNA-binding protein“) an die noch nicht replizierte DNA. Damit wird die Verknäuelung der ss-DNA verhindert. SSB Primase Primosom Später wird das SSB von der vorrückenden DNA-Polymerase wieder von der Matritze abgetrennt. 5‘ 3‘ Okazaki- Stücke Pol III (DNA-Polymerase) 3‘ RNA-Primer DNA-Polymerase I + Ligase Leitstrang Folgestrang

18 Eine konzertierte Aktion bei der Synthese von Leit- und Folgestrang
jedoch: ein- und dieselbe DNA-Polymerase III synthetisiert gleichzeitig Leit- und Folgestrang!

19 „Schleifenbildung“ am Folgestrang bei der DNA-Replikation
Helicase Primosom Bewegungsrichtung der Replikationsgabel Schleifenbildung DNA-Polymerase III Holoenzym-Dimer Primer DNA-Polymerase III Holoenzym-Dimer Primer Okazaki- Stück Leitstrang Folgestrang

20 Schleifenbildung bei der Synthese von Leit- und Folgestrang
Primosom Helicase DNA-Polymerase III Holoenzym-Dimer Primer Schleifenbildung 3‘ 5‘ 3‘ 5‘ 3‘ 5‘ Okazaki- Stück DNA-Polymerase III Holonenzym-Dimer

21 DNA-Polymerase III Holonenzym-Dimer Die Schleifenbildung an der DNA-Folgestrangmatritze ermöglicht der dimeren DNA-Polymerase III die Synthese beider Tochterstränge in der Replikationsgabel. Dadurch wird die physikalische Richtung am Folgestrang, nicht aber die biochemische Richtung (5´>3´) umgedreht

22 Eine konzertierte Aktion bei der Synthese von Leit- und Folgestrang
Leitstrang Griff Bewegungsrichtung der Replikationsgabel Klammer DNA-Polymerase III Helicase Primase Topoisomerase Ligase RNA-Primer DNA-Polymerase I SSB Okazaki- Stücke RNA-Primer Folgestrang

23 Die gleichzeitige Synthese von DNA Leit- und Folgestrang durch die dimere DNA-Polymerase III

24 Eine Computer-Animation: gleichzeitige Synthese von DNA Leit- und Folgestrang durch das Holo-Enzym DNA-Polymerase III

25 Fragen aus der schriftlichen Physikumsprüfung
53 Essentielle Grundlage des Lebens ist die Fähigkeit der identischen Reduplikation des genetischen Materials und damit letztendlich der Vererbung einer funktionsfähigen Zellstruktur. Welche Aussage zur Replikation der DNA trifft zu? (A) Beim Start der Replikation werden RNA-Primer synthetisiert. (B) Die Neusynthese der DNA erfolgt an beiden Strängen einer Replikationsgabel in kürzeren Stücken, so genannten Okazaki-Fragmenten. (C) Für die Verknüpfung der DNA-Fragmente nach Entfernen der Primer phosphoryliert die DNA-Ligase das 3’-OH-Ende eines Fragmentes. (D) Helicasen schützen intermedär gebildete einzelsträngige DNA-Bereiche vor Schädigungen und Strangbrüchen. (E) Interkalatoren, die als Zytostatika in der Tumortherapie eingesetzt werden, binden spezifisch die DNA-Polymerasen.

26 Die Entwindung des DNA-Matritzenstrangs während der DNA-Replikation führt zu Verdrillungen

27 Transienter Bruch des einen Strangs
dadurch Verdrillung der DNA Entwinden der DNA während der Replikation durch die Helicase Replikation Transienter Bruch des einen Strangs erlaubt freie Rotation der DNA-Stränge und Entdrillung der beiden Stränge >>katalysiert durch DNA-Topoisomerase

28 Fragen aus der schriftlichen Physikumsprüfung

29 Fragen aus der schriftlichen Physikumsprüfung

30 Nukleosomen-Assemblierung nach DNA-Replikation in Eukaryonten

31 Telomerase mit RNA Primer
Die Enden der menschlichen Chromosomen sind linear >>> Probleme bei der Replikation Telomerase mit RNA Primer

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