Methodenvergleich PCR-SSP/SSO

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1 Methodenvergleich PCR-SSP/SSO
Testsysteme SSP:BAG,Dynal,Olerup SSO:Elpha,Dynal Reli

2 Vergleich SSP-SSO SSP: Sequenz spezifische Primer
SSO: Sequenz spezifische Oligonukleotide Elpha: Enzyme linked probe hybridization essay Reli: reverse line dot blot essay

3 Vergleich SSP-SSO Überprüft auf : Eindeutigkeit des Ergebnisses
Notwendigkeit von Wiederholungen Auflösungsvermögen und detektierte Allele methodische Probleme Auswertung Kosten und Materialverbrauch Zeitaufwand

4 Vergleich SSP - SSO SSP Ergebnis nach Amplifikation Zeitgewinn SSO
Cyclerbedarf geringer Probendurchsatz größer DNA-Bedarf geringer oft bereits im low-resolution-Set hohe Auflösung

5 Prinzip der PCR-SSP Genomischer DNA-Doppelstrang bei
Erhitzung auf >92°C denaturiert.

6 Prinzip der PCR-SSP Primerannealing bei 37 - 72°C 5´ 3´ 3´ 5´
Antisenseprimer 3´ 3´ Senseprimer 5´

7 Prinzip der PCR-SSP Elongation durch Taq-Polymerase bei 72°C
Wiederholung Denaturierung, Annealing und Elon- gation, bis PCR-Cyclen beendet. 5´ 3´ 3´ 5´

8 Prinzip des Dynal RELI Strepavidin- Ziel-DNA wird mit konjugiertes
Reportermolekül macht Bindung sichtbar (enzymatisch..) Ziel-DNA wird mit biotinmarkierten Primern amplifiziert und dena- turiert auf die Membran gegeben SSO-Moleküle werden auf Membran immobilisiert

9 Erscheinung des Reli-Test

10 Prinzip des Elpha Im letzten Schritt wird das
Substrat, z.B. O-phenylene- diamin, als Farbreaktion umgesetzt Capture Oligo- nukleotid ist an Wand des Reaktions- gefäßes fixiert Streptavidin- reportermolekül ist mit Enzym gekoppelt, das Substratum- wandlung ver- mittelt PCR-amplifizierte biotinylierte DNA bindet an fixiertes SSO

11 Erscheinung Elpha-Test

12 Vergleich SSP - SSO SSP Elpha Reli

13 Vergleich SSP-SSO 27 Proben DRB und 26 Proben DQB in Vergleich
je 4 Homozygote in DRB und DQB pro Probe DRB:BAG,Elpha,Reli DQB:Dynal/Olerup,Elpha, Reli 1 x DQB-SSP allein, 2 x DQB SSP-Reli

14 Vergleich SSP-SSO SSP Elpha Reli
Cycler 47 Min 33,5 Min 48,75 Min (reine Ampl.) Detektion 18 Min 110 Min 100 Min (ohne Auswertung) DNA 12/30 µl 4/2 µl 4 µl (100 ng/ml) DNA 1:1 1:19/1:22 1:72 Verdünnung DQB DRB Schritte ohne Amplifikation

15 Vergleich SSP-SSO Kosten pro Test
SSP Elpha Reli Kitpreis pro Bestimmung DRB 37,- 65,- 45,- DQB 15/12 65,- 42,- Reagenzien dNTP-Puffer 10,5 Taq Polymerase 0,86/0,36 0,36 inklusive Restkosten Material, Fotographie, Zeit... 1,50 6/12Pf 6 Pf

16 Vergleich SSP-SSO Homozygotenerkennung
SSP Elpha Reli DRB 1/ /4 1/4 erkannt 4,- nicht erkannt 3,-;15,-;13,- DQB 3/ /4 4/4 erkannt 6,-;2, ,-;2,- 6,-;2,- nicht erkannt 6, ,-;2,-

17 DRB-Allele der Sets

18 DQB-Allele der Sets

19 Reli-Auswerteprogramm

20 Elpha-Auswerteprogramm

21 Vergleich SSP-SSO Elpha-Frequenzentscheidung

22 Vergleich SSP-SSO Allelfrequenzen DQB (KM)

23 Vergleich SSP-SSO eindeutige Ergebnisse
SSP Elpha Reli h/v a/v DR DR2 DRB 63% 85% 19% 52% 41% 70% SSP Elpha Reli alle Primerausfall DQB 93% 77% 75% 100%

24 Vergleich SSP-SSO Auflösung
DRB SSP 15,5% Elpha h/v 82% a/v 19,6% Reli 48,3% DQB SSP 30% Elpha h/v 77% a/v 74% Reli 71%

25 Vergleich SSP-SSO Wiederholungen
SSP Elpha Reli h/v a/v DR DR2 DRB - insgesamt 37% 15% 81% 41% 59% 30% - Ausfälle 19% 7% 11% - Ag Ausschl. 22% 7% 44% 26% - DR2 0% 4% 33% % DQB - insgesamt 7% 62% 0% - Ag Ausschl. 7% - Ausfälle 0% 15%

26 Vergleich SSP-SSO SSP-Problemfälle
DRB: BAG-Set kann bei Vorliegen von DRB1*13 *1424 nicht sicher ausschließen bei Vorliegen von *13,- kann auch *1130 nicht ausgeschlossen werden bei Vorliegen von *3,- kann auch *1420 nicht ausgeschlossen werden Sets von Dynal oder Biotest zeigen dieses Problem nicht

27 Vergleich SSP-SSO SSP-Problemfälle
DQB in einem Fall einer DQB1*06 Homozygotie war ein *0304 nicht auszuschließen in einem Fall einer DQB1* Homozygotie war eine *03032 und *0306 nicht sicher auszuschließen DQ 3 Splitaufteilung nur in DQ 7 möglich

28 Vergleich SSP-SSO Elpha-Problemfälle
DRB bei Vorliegen von DRB1*03/04 und *11/12 ist im Bewertungsmodus alle/vollständig auch *13 und *14 möglich zusätzlich sind bei Vorliegen von *03,*07,*11,*12,*08 ebenfalls *13 oder *14 möglich

29 Vergleich SSP-SSO Elpha-Problemfälle
DQB in Primermixen A oder B trotz positiver Kontrollbande kein spezifisches Amplifikat in 31% der Amplifikationen; in diesen Fällen nur bei 75% korrelierendes Ergebnis Wenn in jedem Mix spezifisches Amplifikat korrektes Ergebnis in 78% d.F.

30 Vergleich SSP-SSO spezieller Fall Elpha
DNA Probe SSP und Reli DQB1*02,- Elpha-Test: 1) alle Kontrollen positiv DQB1* 0301,0601 2) PM A kein spezif. Amplifikat DQB1* 020x,030x 3) PM A kein spezif. Amplifikat DQB1* 02,-

31 Vergleich SSP-SSO Reli-Problemfälle
DRB Bei Vorliegen von 3,- oder 13,- Homozygotie ist auch heterozygote 13,3 möglich Bei HLA-DRB1*11,12 kann *13 nicht ausgeschlossen werden Im Falle DRB1*03,11 wird homozy- got 3,- oder 11,- von der Auswerte- software als wahrscheinlich angegeben

32 Vergleich SSP-SSO Reli Problemfälle
DQB es steht keine Auswertesoftware zur Verfügung

33 Vergleich SSP-SSO spezieller Fall Reli
DNA Probe SSP-Ergebnis DRB1*03,11 Reli Auswertesoftware: 1) 0308,- 2) 1109,- 3) 03xx,0308 4) 03xx,11xx reproduzierbar

34 Bewertung Elpha-Test Vorteile: Nachteile: stabile DRB Amplifikation
automatisches Waschen Gesamtprozeß-automatisierung verfügbar Mit Update ist eine Auswertung auch früherer Daten hinsichtlich neuer Allele möglich für DR2-Auftrennung werden Primer mitgeliefert Nachteile: instabile DQB Amplifikation je nach Softwareeinstellung werden bestimmte Allele aus der Bewertung ausgeschlossen sehr abhängig von technischer Ausstattung, die bei Defekt die Testdurchführung unmöglich macht Pipettierarbeit zeit- und materialaufwendig Dokumentation der Reaktion nur als Photometermeßwerte im PC und auf Ausdruck viel Material nicht im Lieferumfang

35 Bewertung Reli-Test Vorteile: Nachteile: sehr stabile Amplifikationen
Testdurchführung mit wenig Materialaufwand Streifen sind zur Dokumentation archivierbar HLA-A und -B bereits verfügbar kaum mechanische oder elektrische Geräte nötig Nachteile: für DQB keine Auswerte-software keine Automatisierung der Waschschritte oder des gesamten Ablaufs verfügbar schlechte optische Aufbereitung des Befundausdrucks

36 Bewertung SSP Vorteile: Nachteile: stabile Amplifikationen
Fotos des Gelbildes zur Dokumentation archivierbar teilweise Automatisierung verfügbar Nachteile: hoher Platzbedarf im Thermocycler ausgefallene Amplifikationen machen Neuansatz des gesamten Sets nötig höhere Kosten für Polymerase mehr Ethidiumbromid-gele als Sonderabfall mehr Pipettieraufwand für einen Patienten