Methoden 1. 19.09.2018 Sebők Ágnes.

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1 Methoden 1. Sebők Ágnes

2 Molekulare Zellbiologie
Molekularbiologische Methode I. DNA Sebők Ágnes

3 DNA-Struktur Primärstruktur: Sequenz der Nucleotiden, lineare Polymer,
Phosphodiestherbindungen Sekundärstruktur: Doppelhelix, H-Brücken Tertiärstruktur: Superhelix Quarternärstruktur: DNP, Chromatin Sebők Ágnes

4 Sekundärstruktur DNA Die Faltung der Makromolekül
Nichtkovalente Bindungen DNA Doppelhelix stabilisiert durch H-Brücken Sebők Ágnes

5 In vivo: In vitro: Hybridiesierung Enzymatisch Wärme (PCR)
(DNA-Replikation, Transcription) In vitro: Wärme (PCR) alkalische Lösungen (Southern-blot) Formamid und Harnstoff (Sequenzierung) Sebők Ágnes

6 Sekundär- (Tertiär, Quaternär-) struktur nichtkovalente-Verbindungen
Denaturierung: Sekundär- (Tertiär, Quaternär-) struktur nichtkovalente-Verbindungen Hydrolyse: Primärstruktur kovalente Verbindungen Sebők Ágnes

7 UV-Absorption der DNA Absorptionsmaximum : 260 nm
Konzentrationsbestimmung Bei Denaturierung steigt der UV-Absorption Sebők Ágnes

8 Schmelztemperatur -Tm
diejenige Temperatur, bei der sich 50% der DNA-Stränge trennen steigt mit zunehmenden G/C-Gehalt der DNA (3 H-Brücken) Sebők Ágnes

9 Molekularbiologische Methoden
Restriktionsendonucleasen Cloning Molecular hybridisation Southern blot Sequencing PCR Genom library Sebők Ágnes

10 Filter-Hybridisierung
Denaturierung Filterbindung Hybridiesierung mit der Probe (radioaktive) Waschen Radiokativität messen Fragen: Anwesenheit der komplementäre Strang Quantität der komplementären DNA/RNA Sebők Ágnes

11 In situ Hybridisierung
Mikroskopisches Preparat Denaturierung Hybridiesierung mit der Probe (fluorescent) Waschen Fluorescent Mikroskop (Lichtmikroskop) Fragen: Anwesenheit des komplementären Stranges Wo? Sebők Ágnes

12 Die Restriktionsendonuclease
Nuclease – schneidet Phosphodiesterbindungen in Nucleinsäure Endo/Exo – Nuclease Restriktion – Erkennungstellen bzw. Bakterielle Restriktion-Modifikations-System Sebők Ágnes

13 Die Restriktionsendonuclease
dsDNA-specifische Endonuclease, mit einer specifischen Erkennungssequenz Palindrom adhäsive oder glatte Ende Sebők Ágnes

14 Restriktionskarten Verdau mit RE Agarose Gelelectrophorese
Wanderung zur positiven Electrode Größere Fragmente wandern langsamer Fluoreszierende Farbstoff die an DNA bindet Relative Lagerung der RE-Erkennungsequenzen kann determiniert werden. Sebők Ágnes

15 Separierung der freien Nucleotiden von DNA-Strangen
In Vitro DNA-Synthese DNA-Polymerase DNA-Matrize Primer 4 dNTPS , ein radioaktiv markiert Puffer ****** Separierung der freien Nucleotiden von DNA-Strangen Sebők Ágnes

16 Enzymatische DNA-Sequenzierung
In vitro DNA-Synthese Primer (oder dNTP) radioaktiv markiert ddNTP (die 3’-OH-Gruppe fählt) 4 in vitro Reaktionen mit 4 verschiedenen ddNTPs (1:10) Denaturierende Electrophorese (PAGE mit Harnstoff und Formamide) Autoradiographie Sebők Ágnes

17 Polymerasekettenreaktion (PCR)
In vitro DNA-Synthese Hitzestabile DNA-Polymerase Primer-Paar Zyklen: 1. Denaturierung (95 C) 2. Primer-Bindung (60 C) 3. Primer-Verlängerung (60-70 C) Gelelectrophorese Sebők Ágnes

18 PCR Existenz einer Sequenz in der DNA-Mischung
Klonierung (Amplifizierung) Länge der DNA-Fragment -Mutationsanalyse Sebők Ágnes

19 Molekulare Zellbiologie
Molekularbiologische Methode - Genexpression Sebők Ágnes

20 Polymerasekettenreaktion (PCR)
In vitro DNA-Synthese Hitzestabile DNA-Polymerase Primer-Paar Zyklen: 1. Denaturierung (95 C) 2. Primer-Bindung (60 C) 3. Primer-Verlängerung – DNA synthese (60-70 C) (Gelelectrophoresis) Sebők Ágnes

21 PCR - Anwendung (Fragen)
Existenz einer Sequenz (Infections, Krebs) Klonierung (Amplifizierung) Mutationsanalyse (Länge der DNA-Fragment) Quantität einer Sequenz – Real-time PCR Sebők Ágnes

22 Real-time PCR In vitro DNA-Synthese Primer-Paar
Hitzestabile DNA-Polymerase Primer-Paar Dritte Primer : mit fluroreszent Farbsott und Auslöscher Polimerase macht fluoreszent Farbstoff frei – gleichzeitige (real-time) Quantifikation Sebők Ágnes

23 Genexpression DNA mRNA Protein Phenotyp Transcription Translation
Protein-Function Phenotyp Sebők Ágnes

24 Gentechnik in vivo Expression von fremden Genen
Hinderung der endogenen Gen-Expression Sebők Ágnes

25 Gentechnik in vivo 1. Expression von fremden Genen
Gen-Transfer in Zelle Transgene Organisme Sebők Ágnes

26 Hinderung der endogenen Genexpression – I.
I. DNA KO-mutation Sebők Ágnes

27 Hinderung der endogenen Genexpression – II.
II. RNA Antisense RNA Ribosyme RNA-Interferenz Sebők Ágnes

28 Hinderung der endogenen Genexpression – III.
III. Proteine Microinjection von Antikörper Intrazellulläre Antikörper Expression von dominanten hemmenden Proteinen Peptidomimetiken Sebők Ágnes

29 mRNA Sebők Ágnes

30 Molekulare Zellbiologie
Transcription und Processing der mRNA Sebők Ágnes

31 Transcription der mRNA
RNA Polymerase II. Nucleoplasma Primärtranscript: pre-mRNA = hnRNA (heterogen nuclear RNA) Untereinheiten: Histon-acetyltransferase Helicase Posttranscriptionale Modifizierungen Sebők Ágnes

32 Initiation der mRNA-Synthese
Promoter: Core P: TATA-box Enhancer Transcriptionsfaktoren allgemeine regulatorische Sebők Ágnes

33 RNA-Capping 5‘-Ende Enzyme: 5‘-5‘ Verknüpfung, Triphosphat-Brücke
Nucleotide Phosphohydrolase Guanyltransferase Methyltransferase 5‘-5‘ Verknüpfung, Triphosphat-Brücke Function: Stabilität der mRNA (histon mRNA-s ohne poly-A) Export aus dem Zellkern Ribosome-Bindung (Proteinsynthese) Sebők Ágnes

34 Polyadenierung 3‘-Ende
Poly-A Signalsequenz Endonuclease Poly-A-Polymerase Poly(A) Schwanz: Ns. Function: Stabilität der mRNA Export aus dem Zellkern Sebők Ágnes

35 Struktur der pre-mRNA und mRNA
Intron – Exon 5‘ und 3‘-nichtkodierender Bereich Cap und poly-A-Schwanz Sebők Ágnes

36 RNA-Spleißen Introns Entfernen und Exons miteinander verbinden
5‘ und 3‘ Spleiße-Signalsequenzen snRNP: Rybosym Sebők Ágnes

37 RNA-Spleißmechanismus
5‘ - U1 ; 3‘ – U2 U4/U6 und U5 Schnitt an der 5‘-Spleisstelle Lariatbildung (Schlaufe) Schnitt an der 3‘-Spleisstelle Verbindung der Exonsequenzen Sebők Ágnes

38 Spleißung-Krakheiten
SLE (systemische Lupus erythematodes) Autoimmunerkrankung Anti-snRNP-Antikörper Thalassemia Anaemia: a- und b-Globin-Synthese ist ruduziert Mutation der Spleisstelle Sebők Ágnes

39 Replikation 1. Sebők Ágnes

40 Molekulare Zellbiologie
Replikation der DNA Sebők Ágnes

41 Das Kornberg-System Matrize-DNA DNA-Polymerase
4 dNTP (ein radiaoaktiv markiert) Puffer-Lösung (kein Primer !) Sebők Ágnes

42 Das Kornberg-Experiment
·       Synthese ·   TCA-Precipitierung ·   Filter-Bindung ·    Waschen (TCA) ·     Messung der Radioaktivitat: Flüssigkeitszintillations-Zahler Sebők Ágnes

43 Das Kornberg-Experiment
1.  DNA ist in vitro synthetisiert (Die Filter ist radioaktiv) 2.  DNA –Synthese ist Matrize-abhängig (A+T/G+C - Ratio der Matrize- und neu-synthetisierte-DNA identisch) 3. Reparatursynthese (Quantität der DNA ist reduziert; kein Primer – Einzelstrangbruche, 5’ -> 3’ Exonuclease-Aktivitat) Sebők Ágnes

44 Das Meselson-Stahl Experiment
14N-DNA – leicht, 15N-DNA – schwer Die Zellen wachsen zuerst im 15N dann im 14N-Medium Proben aus der Kultur nach jeder DNA-Replikation Gleichgewichtsdichtegradient-zentrifugation Zentrifugation der denaturierten DNA Sebők Ágnes

45 Bidirektionale Replikation
Replikationsursprung (Origin) Faserautoradiographie 3H-Markierung (heiß danach warm) DNA-Isolation Lichtmikroskopische Autoradiographie Sebők Ágnes

46 Semikonservativ Replikation in eukaryontischen Zellen
H3-Thymidin Markierung wahrend der S-Phase und Entfernung des Isotops (Pulse-Chase) Proben nach jeder Replikation Autoradiographie der Chromosomen Sebők Ágnes

47 5’ –>3’ Richtung der DNA-Synthese
PCR: 5’-3’ – 3’-5’ Primers: Amplifizierung, 2n 3’-5’ – 5’-3’ Primers: Duplizierung, 2n Sebők Ágnes

48 DNA-Synthese ist Primer-abhangig
PCR: Keine Synthese ohne Primers Synthese der DNA-Strecke zwischen der Primers Sebők Ágnes

49 DNA-Synthese ist bidirektional
Replikationsursprung (Origin) Faserautoradiographie: 3H-Markierung (heiss danach warm) DNA-Isolation Lichtmikroskopische Autoradiographie warm - heiss– zero –heiss – warm Sebők Ágnes

50 Faserautoradiographie
Bidirektionale Synthese: warm– heiß – zero – heiß – warm Hypothetische unidirektionale Synthese: Sebők Ágnes

51 DNA-Replikation ist semidiskontinuirlich
Leitestrang, Folgestrang DNA-Ligase Okazaki-Experiment: 3H-Thymidin-markierung von Bakterien Isolation der DNA Separation der DNA nach Strang-Lange: Kleinere Strange (Okazaki-Fragmente) werden miteinander gebunden Sebők Ágnes

52 Eigenschaften der DNA-Replikation (Zusammenfassung)
1. Matrize-abhangig Kornberg-E. 2. dNTP Kornberg-E. 3. Semikonservativ Meselson-Stahl-E. 4. Primer-abhangig PCR 5. 5’->3’ PCR 6. Bidirektional Faserautorad. 7. Semidiscontinuerlich Okazaki-E. Sebők Ágnes