Johann Wolfgang Goethe Universität Frankfurt am Main Fachbereich 15: Biologie und Informatik Junior Prof. Dr. Dirk Metzler Sebastian Bremm 1 Größenbestimmung.

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1 Johann Wolfgang Goethe Universität Frankfurt am Main Fachbereich 15: Biologie und Informatik Junior Prof. Dr. Dirk Metzler Sebastian Bremm 1 Größenbestimmung bei Microarrayexperimenten Klassenvergleiche und Classifier

2 Johann Wolfgang Goethe Universität Frankfurt am Main Fachbereich 15: Biologie und Informatik Junior Prof. Dr. Dirk Metzler Sebastian Bremm 2 Microarrays Dienen zur Erkennung von Expressionsprodukten. Platten aus Glas, Silizium etc. Enthalten die Gene des Organismus. Position jedes Gens auf Platte ist bekannt.

3 Johann Wolfgang Goethe Universität Frankfurt am Main Fachbereich 15: Biologie und Informatik Junior Prof. Dr. Dirk Metzler Sebastian Bremm 3 Versuchsablauf Transkriptionsprodukte (Targets) werden auf das MA gegeben. Diese sind mit Fluoreszenz-Markern versehen. Binden der Targets an den komplementären Strängen auf dem MA. Waschen um nicht oder unzureichend gebundene Targets zu entfernen.

4 Johann Wolfgang Goethe Universität Frankfurt am Main Fachbereich 15: Biologie und Informatik Junior Prof. Dr. Dirk Metzler Sebastian Bremm 4 Auswertung Farbstoffe werden durch Laser zum Leuchten gebracht. Scannen des Bildes. Normalisierung. Fehlerbeseitigung Erstellen der Genexpressionsmatrix.

5 Johann Wolfgang Goethe Universität Frankfurt am Main Fachbereich 15: Biologie und Informatik Junior Prof. Dr. Dirk Metzler Sebastian Bremm 5 Warum Versuchsgrößenbestimmung? Beschränkungen durch: –Finanzmittel –Zeit –Vorhandene Proben

6 Johann Wolfgang Goethe Universität Frankfurt am Main Fachbereich 15: Biologie und Informatik Junior Prof. Dr. Dirk Metzler Sebastian Bremm 6 Klassen-Vergleiche Vergleich von zwei Gewebetypen z.B.: - Krebsgewebe  normales Gewebe - histologisch verschiedene Krebsgewebe Ziel ist es, unterschiedliche Gen- Expressionen zu identifizieren.

7 Johann Wolfgang Goethe Universität Frankfurt am Main Fachbereich 15: Biologie und Informatik Junior Prof. Dr. Dirk Metzler Sebastian Bremm 7 Verschiedene MA-Versuchstypen Single Label/ Double Label –Pooling –Dye Swap –Nutzen von technischen Replikaten

8 Johann Wolfgang Goethe Universität Frankfurt am Main Fachbereich 15: Biologie und Informatik Junior Prof. Dr. Dirk Metzler Sebastian Bremm 8 Single Label Arrays DNA – Oligonukleotid MAs (Affymetrix) Nur Targets einer Zelle Hohe Spotdichte teuer

9 Johann Wolfgang Goethe Universität Frankfurt am Main Fachbereich 15: Biologie und Informatik Junior Prof. Dr. Dirk Metzler Sebastian Bremm 9 Notation Floureszens-Intensität: Y gadvfs –g :1,2,...G | Gen –a :1,...,n | Array –d : 1 = Single Label; 2 = double Label| Farbe –v : 1,2| Phänotypen –f : 1,2,...F| Individuen –s : 1,2,...m| Unterprobe/technisches Replikat

10 Johann Wolfgang Goethe Universität Frankfurt am Main Fachbereich 15: Biologie und Informatik Junior Prof. Dr. Dirk Metzler Sebastian Bremm 10 Single Label MAs Log (Y gadvfs ) = G g + GV gv + (GF) gf(v) +  gadvfs –G g =  Genexpression von g in der Population –GV gv = Effekt der Klasse oder des Typs –(GF) gf(v) = individueller Effekt –  gadvfs = unabh. Fehler mit Normal(0, )

11 Johann Wolfgang Goethe Universität Frankfurt am Main Fachbereich 15: Biologie und Informatik Junior Prof. Dr. Dirk Metzler Sebastian Bremm 11 Single Label MAs

12 Johann Wolfgang Goethe Universität Frankfurt am Main Fachbereich 15: Biologie und Informatik Junior Prof. Dr. Dirk Metzler Sebastian Bremm 12 Single Label MAs

13 Johann Wolfgang Goethe Universität Frankfurt am Main Fachbereich 15: Biologie und Informatik Junior Prof. Dr. Dirk Metzler Sebastian Bremm 13 Single Label MAs

14 Johann Wolfgang Goethe Universität Frankfurt am Main Fachbereich 15: Biologie und Informatik Junior Prof. Dr. Dirk Metzler Sebastian Bremm 14 Dual Label Arrays cDNA MAs Targets von 2 Zellen. Dies erleichtert einen direkten Vergleich Teilweise geringe Spotdichte

15 Johann Wolfgang Goethe Universität Frankfurt am Main Fachbereich 15: Biologie und Informatik Junior Prof. Dr. Dirk Metzler Sebastian Bremm 15 Dual Label MAs Log (Y gadvfs ) = G g + GA ga + GD gd + GV gv + (GF) gf(v) +  gadvfs –G g =  Genexpression von g in der Population –GA ga = Spot auf Array –GD gd = Effekt des Färbemittels –GV gv = Effekt der Klasse oder des Typs –(GF) gf(v) = individueller Effekt –  gadvfs = unabh. Fehler mit Normal(0, )

16 Johann Wolfgang Goethe Universität Frankfurt am Main Fachbereich 15: Biologie und Informatik Junior Prof. Dr. Dirk Metzler Sebastian Bremm 16 Dual Label MAs Referenz Design: A1A1 R A2A2 R B1B1 B2B2 RR

17 Johann Wolfgang Goethe Universität Frankfurt am Main Fachbereich 15: Biologie und Informatik Junior Prof. Dr. Dirk Metzler Sebastian Bremm 17 Dual Label MAs Reference Design Muss aus vorherigen Daten geschätzt werden.

18 Johann Wolfgang Goethe Universität Frankfurt am Main Fachbereich 15: Biologie und Informatik Junior Prof. Dr. Dirk Metzler Sebastian Bremm 18 Dual Label MAs Design mit technischen Replikaten und Dye Swap:

19 Johann Wolfgang Goethe Universität Frankfurt am Main Fachbereich 15: Biologie und Informatik Junior Prof. Dr. Dirk Metzler Sebastian Bremm 19 Dual Label MAs α = 0,001 β = 0,05 δ = 1 Varianz Verhältnis technische Replikate / Sample Anzahl benötigter Arrays Anzahl benötigter Samples 2149 27437 39933 412431 4149 28241 311438 414837

20 Johann Wolfgang Goethe Universität Frankfurt am Main Fachbereich 15: Biologie und Informatik Junior Prof. Dr. Dirk Metzler Sebastian Bremm 20 Dual Label Mas

21 Johann Wolfgang Goethe Universität Frankfurt am Main Fachbereich 15: Biologie und Informatik Junior Prof. Dr. Dirk Metzler Sebastian Bremm 21 Dual Label MAs Block Design: A2A2 A3A3 B2B2 A1A1 B1B1 A4A4 B3B3 B4B4

22 Johann Wolfgang Goethe Universität Frankfurt am Main Fachbereich 15: Biologie und Informatik Junior Prof. Dr. Dirk Metzler Sebastian Bremm 22 Dual Label MAs Balanced Block Design –Leichter Vergleich von 2 Klassen. –Weniger Arrays benötigt. –unflexibel

23 Johann Wolfgang Goethe Universität Frankfurt am Main Fachbereich 15: Biologie und Informatik Junior Prof. Dr. Dirk Metzler Sebastian Bremm 23 Dual Label MAs Single Paired Design –Natürliche biologische Paarungen ( z.B. von Individuum vor und nach einer Behandlung). –Je eine Seite mit einer Farbe pro Probe. –η an Stelle von τ. Varianz des veränderten Gewebes (z.B. Tumor) zum normalen Gewebe.

24 Johann Wolfgang Goethe Universität Frankfurt am Main Fachbereich 15: Biologie und Informatik Junior Prof. Dr. Dirk Metzler Sebastian Bremm 24 Dual Label MAs Dye-Swap Paired Design –Die gleichen Targets wie Single Paired Design. –Die gleichen Arrays werden nocheinmal mit dem jeweils anderen Fluoreszensstoff ausgewertet.

25 Johann Wolfgang Goethe Universität Frankfurt am Main Fachbereich 15: Biologie und Informatik Junior Prof. Dr. Dirk Metzler Sebastian Bremm 25 Prognostic Markers Finden von Genen oder Genklassen, die bei einer Krankheit exprimiert werden.

26 Johann Wolfgang Goethe Universität Frankfurt am Main Fachbereich 15: Biologie und Informatik Junior Prof. Dr. Dirk Metzler Sebastian Bremm 26 Prognostic Markers Effekt von Pooling Mehr Samples  weniger Arrays

27 Johann Wolfgang Goethe Universität Frankfurt am Main Fachbereich 15: Biologie und Informatik Junior Prof. Dr. Dirk Metzler Sebastian Bremm 27 Prognostic Markers α = Wahrscheinlichkeit für falsch positive Entdeckung. 1-β = Wahrscheinlichkeit richtig positive Entdeckung. Problem: Wie wählt man α?

28 Johann Wolfgang Goethe Universität Frankfurt am Main Fachbereich 15: Biologie und Informatik Junior Prof. Dr. Dirk Metzler Sebastian Bremm 28 Prognostic Markers

29 Johann Wolfgang Goethe Universität Frankfurt am Main Fachbereich 15: Biologie und Informatik Junior Prof. Dr. Dirk Metzler Sebastian Bremm 29 Prognostic Markers

30 Johann Wolfgang Goethe Universität Frankfurt am Main Fachbereich 15: Biologie und Informatik Junior Prof. Dr. Dirk Metzler Sebastian Bremm 30 Prognostic Markers

31 Johann Wolfgang Goethe Universität Frankfurt am Main Fachbereich 15: Biologie und Informatik Junior Prof. Dr. Dirk Metzler Sebastian Bremm 31 Training eines Classifiers Ein Classifier soll Gene als Prognostic Marker erkennen.

32 Johann Wolfgang Goethe Universität Frankfurt am Main Fachbereich 15: Biologie und Informatik Junior Prof. Dr. Dirk Metzler Sebastian Bremm 32 Training eines Classifiers Bedingung: Solle wenige Samples brauchen Lösung: Sequentielle Bestimmung Vorteile –Lernt durch eigene Erfahrung. –Stopp-Kriterium wird bei jedem Schritt überprüft. –Erzielen der gewünschten Signifikanz garantiert –Mit jeder Klassifikationsmethode einsetzbar.

33 Johann Wolfgang Goethe Universität Frankfurt am Main Fachbereich 15: Biologie und Informatik Junior Prof. Dr. Dirk Metzler Sebastian Bremm 33 Training eines Classifiers