MARKER DEFINITION & ANWENDUNGSMÖGLICHKEITEN

Präsentation zum Thema: "MARKER DEFINITION & ANWENDUNGSMÖGLICHKEITEN"—  Präsentation transkript:

1 MARKER DEFINITION & ANWENDUNGSMÖGLICHKEITEN
Einteilung nach Ausgangsmaterial 1. Genomische DNA – nach Restriktionsverdau 2. RNA – nach Umschreiben in cDNA Einteilung nach der verwendeten Technik 1. Einsatz von Sonden 2. Screen-Prinzip (in Verbindung mit selektiver PCR)

2 MARKER DEFINITION & ANWENDUNGSMÖGLICHKEITEN
Einteilung nach der verwendeten Technik 1. Einsatz von Sonden 2. Display-Prinzip (in Verbindung mit selektiver PCR) Experiment: Genomische DNA wird isoliert (z.B. Arabidopsis, ca. 120 Mbp) und verdaut (z.B. mit EcoR1, Erkennung von 6 Basen G/AATTC). Führt zu etwa Restriktionsfragmenten. Die sind auf keinem Gel auflösbar. Es wird nur ein Schmier beobachtet. Was tun ? ( classical quotation)

3 MARKER-Typen 1. PHÄNOTYP: meist unbekannte Art von Unterschied
2. RFLP: restriction fragment length polymorphism 3. AFLP: amplified fragment length polymorphism 4. SSLP: simple sequence length polymorphism 5. SSR: simple sequence repeat (Mikrosatellit) 6. SNP: single nucleotide polymorphism 7. CAPS: cleaved amplified polymorphic sequences 8. RAPD: random amplified polymorphic DNA

4 2. RFLP

5 2. RFLP Unterschied im Restriktionsmuster der Genome zweier Individuen
Gelanalyse Zusätzliche Restriktionsschnittstelle Diese unterschiedlichen Fragmente können wegen der Vielzahl der Restriktionsfragmente aber nicht „gesehen“ werden.

6 2. RFLP Restriktionsfragment-Längenpolymorphismus
Mit einer Hybridisierungssonde kann man Mutationen nachweisen Restriktionsfragment-Längenpolymorphismus

7 2. RFLP Mit dem RFLP-Marker können wir den Genotyp bestimmen

8 3. AFLP

9 3. AFLP „SPEZIFISCHE PCR“
Über- Anteil Genom Pflanze hang ampl bp / Bakterien / Bakterien / Hefe / Arabidopsis / Reis / Zuckerrübe 7 1/ Gerste 8 1/ Weizen

10 3. AFLP VORTEIL Robustes, reproduzierbares Verfahren, das wegen der hohen Zahl amplifizierter Fragmente meist mehrere polymorphe Banden in einem Experiment liefert. Kann an einen weiten Bereich von Genomgrößen angepasst werden. NACHTEIL 1. DNA-AFLP: Banden (Merkmale) sind kaum Genen zuzuordnen 2. cDNA-AFLP: komplexe und teure Prozedur

11 4. SSLP simple sequence length polymorphism
- PCR-gestützte Markertechnik (display-Technik) - Zu untersuchende Bereich wird mit sequenz-spezifischen primern überdeckt und mittels PCR amplifiziert - Die enstehenden Fragmente werden mit Agarose-Gel-Elektrophorese in Gegenwart von Ethidiumbromid nach Größe aufgetrennt und verglichen.

12 4. SSLP Insertion (Analog Deletion) Autoradiogramm Primer I Primer II

13 5. SSR simple sequence length polymorphism
Unterschiedliche Zahl von Wiederholungen einfacher Di- und Trinukeotidsequenzen (TG)10 (TG)12 ENTSTEHUNG „Stottern“ der Polymerase bei der Replikation VORTEIL Schnelle Veränderung der Anzahl von Wiederholungen solcher Sequenzen in evolutionär kurzen Zeiträumen, d.h. auch Nutzpflanzenvarietäten zeigen noch Polymorphie

14 6. SNP single nucleotide polymorphism
Unterschied in einem einzigen Basenpaar A C VORTEIL SNPs sind häufig auch zwischen nahe verwandten Individuen (im Humangenom ca. 0,1% aller Basenpaare)

15 6. SNP Fluorescence resonance energy trasfer (FRET)
Temperaturabhängigkeit

16 6. SNP Fluorescence resonance energy trasfer (FRET)
Temperaturabhängigkeit

17 7. CAPS Cleaved amplified polymorphic sequences
primer A C Genom 1 Genom 2 neue Schnittstelle 1. PCR-Amplifizierung 2. Restriktionsverdau 3. Gelelektrophorese Genom 2 Genom 1 Gelektrophorese

18 8. RAPD random amplified polymorphic DNA
Unterschiede bei der Bindung von Oligonukleotiden willkürlicher Sequenz und der daraus resultierenden unterschiedlichen Amplifizierbarkeit kurzer genomischer Fragmente Genom Individuum 1 Genom Individuum 2 Gelanalyse

19 Einsatz von molekularen Markern
zur Lokalisierung von Mutationen und TILLING Auf jeden Fall aber Diagnostik

20 1. Anwendung molekularer Marker 2. Diagnostik und Pflanzenschutz
Einsatz von molekularen Markern zur Lokalisierung von Mutationen und TILLING Auf jeden Fall aber Diagnostik 1. Anwendung molekularer Marker 2. Diagnostik und Pflanzenschutz

21 2. Diagnostik und Pflanzenschutz
Einsatz von molekularen Markern zur Lokalisierung von Mutationen und TILLING Auf jeden Fall aber Diagnostik 1. Anwendung molekularer Marker 2. Diagnostik und Pflanzenschutz - Viroide - Viren - Bakterien - Pilze

22 1. Viroide Praktische Nachweismöglichkeit: bidirektionale Elektrophorese Largely internally base-paired viroid RNA BT p nativ denat.

23 2. Viren Polyklonale Antikörper Trübungsmessung, automatisierbar

24 3. Bakterien Bindung der Bakterien mittels Antikörper an
Magnetpartikel.

25 3. Bakterien Entfernung der Targets mit einem Magneten.
Kultivierung der isolierten Bakterien. Klassischer Nachweis.

26 3. Bakterien

27 4. Pilze RAPD