Agarosegelelektrophorese Agarosegelelektrophorese

Präsentation zum Thema: "Agarosegelelektrophorese Agarosegelelektrophorese"—  Präsentation transkript:

1 Agarosegelelektrophorese Agarosegelelektrophorese
Probensammlung URINE PROBEN GEWEBE (TURBT/CE) Urinsediment (Vergrößerung...) V73 Urinzytologie (Begutachtung durch A.Twelker-Baldauf) In flüssigem Stickstoff aus OP holen, dann wegfrieren V30/31 V60 Vorbereitung für RNA-Extraktion V73 Kryoschnitte RNA-Isolation mittels Invisorb HE-Färbung (Begutachtung TZG durch Pathologin M.Toma) RNA-Isolation mittels Invisorb V17 V13 V59 Bestimmung RNA-Gehalt am Agilent Je nach RNA-Konz. Vx= 500ng/cAgilent a) > 50ng->ml-Menge mit 500ng ausrechen und A.d. bis zu 10µl ergänzen b) < 50ng + <39µl: Vx abpipettieren, Einengen in Speed Vac+in 10µl A.d.lösen500ng c)<50ng + >39µl: komplett einrotieren+in A.d.lösen39-fache Ausgangskonz. V62 cDNA-Synthese mittels Superscript RNAse H Reverse Transcriptase (blind->anfängliche Messung am Agilent->immer „nichts drin“gewesen, weil Konz.zu niedrig) V58 cDNA-Synthese mittels Superscript RNAse H Reverse Transcriptase LC-PCR Referenzgen(e) cDNA 1:2 verdünnt; NWG= 20mol (unverdünnt) V58 V45 LC-PCR Referenzgen(e)+BCa-Marker cDNA 1:5 verdünnt; NWG= 50 mol (unverdünnt) LC-PCR BCa-Marker V45 Agarosegelelektrophorese (Kontrolle Doppelbanden) Agarosegelelektrophorese (Kontrolle, ob Doppelbanden) V42 V42

2 Etablierung neuer Gene (UCA1/CK20)
BLOCK-PCR Gradienten-PCR? Fragmentlänge UCA1: 95bp; CK20 490bp: 78bp Agarosegelelektrophorese 1 Bande an gewünschter Stelle? V42 Richtiges (sauberes) Fragment Großansatz Block-PCR Agarosegelelektrophorese V42 Bande ausschneiden Gelelution mit Fa.Amersham V43 Konzentrationsbestimmung am Photometer Evtl.am Agilent für genauere Konzentrationsbestimmung bei geringen Konz. V32 Ligation von DNA-Fragment (Insert) in Vektor (bei Amplifikation m.Taq-Polymerase: Poly-A-Schwanz schon am Fragment vorhanden) V34 KLONIERUNG Transformation mittels Elektroporation Transformation mittels Hitzeschock V36 V35

3 Ausstreichen auf LB-Platten
Inkubation bei 37°C über Nacht (ÜN) Einbau des Fragments in Vektor in LAC-Z-Gen o.gar kein Plasmid enthalten  keine Umwandlung X-GAL Kein Einbau des Fragments in Vektor  Umwandlung X-GAL Blue-White-Screening Blaue Bakterienkolonie Weiße Bakterienkolonien Klone picken (ca.2-4) Jeweils 1 Einzelkolonie in 2ml LB-Medium+Antibiotika (Verhinderung Wachstum anderer Kolonien) Agarplatte mit restlichen Kolonien verbleibt bis zum Ende der Klonierung (mit Plastikfolie abgedeckt) im Kühlschrank  Nachpicken jederzeit möglich Inkubation ÜN bei 37°C in Schütteltruhe bei 300rpm Plasmid-Minipräparation von allen gepickten Klonen V37 Nachzucht Klon mit gewünschtem Fragment (0,5ml) Kontrollverdau mit NotI bzw.EcoRI (1,5ml) V41 Agarosegelelektrophorese mit Verdau-Ansatz+unverdauten Ansatz V42 Falls Menge des Plasmidpräp nicht ausreichend 0,5ml Baktriensuspension+2 0der 4ml LB-Medium  Inkubation ÜN (auf diese Art immer wieder mgl.Klone „hochzuzüchten“) 2 Banden im verdauten Ansatz (Vektor+Fragment) Sequenzierung durch GATC (mind.1-2 Klone mit gewünschtem Fragment; 30µl Plasmid-DNA (100ng/µl) GVO (genet.veränderter Organismus) von allen Klonen, die laut Sequenzierung gewünschtes Fragment enthalten (ca.2)

4 Quantitative PCR m.Light Cycler
Beschichtung LightCycler-Kapillaren (Roboscreen) Quantitative PCR m.Light Cycler