PCR (Polymerase Chain Reaction)

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1 PCR (Polymerase Chain Reaction)
Themen: Geschichte (Kathrin Jessica Lisa K.) Ablauf (Gerrit Svenja Annabel Anne-Marie) Tandem (Björn Sebastian) Fingerabdruck (Lisa D. Catharina Sarah) Mutagenese (Joshi Robert Daniel H. Nils) Erbkrankheiten (Ela Agnes Alexandra Larissa) Vaterschaftstest (Rebecca Kristine) Klonierung (Daniel B. Stefan)

2 Geschichte Anfang der 70er Jahre kam Har Gobind Khorana auf den theoretischen Gedanken, DNA durch zwei flankierende Primer (werden vom Enzym Primase aus einzelnen Nukleotiden hergestellt) zu vervielfältigen, die Idee geriet jedoch recht schnell in Vergessenheit. Die Polymerase-Kettenreaktion, kurz PCR, wurde 1983 von dem amerikanischen Biochemiker Kary Banks Mullis erfunden; Er erhielt hierfür 1992 den Nobelpreis. Seine Idee war es, ein Verfahren zu entwickeln, das DNA durch wiederholte Verdoppelung in mehreren Zyklen mit Hilfe eines Enzyms namens DNA-Polymerase künstlich vervielfältigt. DNA-Polymerase kommt in allen Lebewesen vor und verdoppelt bei ihnen die DNA vor der Zellteilung. Dazu bindet sie sich an einen einzelnen DNA-Strang und erzeugt einen dazu komplementären Strang ( Negative von Fotos). Bereits in Mullis' ursprünglichem PCR-Versuch wurde das Enzym in vitro verwendet. Mullis arbeitete zu dieser Zeit für die Firma Cetus und wurde mit einer Prämie von US-$ abgefunden. jahre später verkaufte Cetus die Rechte an der PCR-Methode mitsamt dem Patent für die von ihm verwendete DNA-Polymerase Taq an die Firma Roche, für 300 Millionen US-$. Das Enzym Taq wurde jedoch bereits 1980 von dem russischen Forscher Kaledin beschrieben, weshalb dieser nach einem jahrelangen Rechtsstreit der Firma Roche das Patent entziehen ließ. Die Taq-Polymerase erfährt nach wie vor breite Anwendung. Ihr Nachteil liegt jedoch darin, dass sie manchmal Fehler beim kopieren der DNA produziert, was zu Mutationen führt.

3 Ablauf Ablauf PCR -Der PCR Prozess besteht aus Zyklen - Zyklus = 3 Schritte - Im Thermozykler wird dei doppelsträngige DNA bei 94°-96°C getrennt (Denaturierung) - Wasserstoffbrückenbindungen werden aufgebrochen - 1. Zyklus = lange Zeit der Erhitzung, für vollständige Trennung => Einzelstränge -anschließend: Senkung der Temperatur => Primer an Einzelstränge (Primerhybridisierung); Temp. nun bei 50-65°C (2-3°C unter Schmelzpunkt) - bei falscher Temeratur wird der Prozess unterbrochen: zu hohe Temp.: Primer lagern sich nicht an zu niedrige Temp.: Primer lagern sich an falschen Stellen an - DNA Polymerase füllt fehlende Stränge mit freien Nukleotiden auf (beginnt am Primer u. folgt dem DNA-Strang) -> Elongation = Verlängerung - Primer wird nicht mehr abgelöst - Temp. und Zeit hängen von der Polymerase und der Länge des DNA-Fragments ab (Temp. liegt bei 68-72°C )

4 Ablauf Schritte des PCR Prozesses 1. Initialisierung. Das Gemisch wird 5 Minuten lang auf 96 °C erhitzt, um sicherzustellen, dass die DNA-Stränge und Primer sich getrennt haben. Auch werden Taq-Polymerasen durch diese Erhitzungs-Phase aktiviert. Die DNA-Polymerase kann vor oder nach der Initialisierung zugefügt werden. 2. Zerlegen. Die Temperatur 30 Sekunden lang auf 96 °C halten. Das genügt gewöhnlich, um die DNA während der Zyklen zu zerlegen. 3. Anlagerung. Die Temperatur 30 Sekunden lang auf 68 °C halten. 4. Verlängerung. Die Temperatur 45 Sekunden lang auf 72 °C halten. Die Schritte 2-4 werden 25 mal wiederholt. Mit guten Primern und frischer Polymerase genügen 15 bis 20 Zyklen. 5. Das Gemisch wird bei 7 °C aufbewahrt. Es bietet sich an, die PCR am Abend vor dem Verlassen des Labors einzuleiten, so dass sie über Nacht laufen kann. Die DNA wird bei 7 °C nach nur einer Nacht nicht beschädigt.

5 Tandem Eine Tandemwiederholung ist ein sich wiederholendes Sequenzmotiv in der DNA oder RNA . Beispiel: AGTAGTAGTAGT oder ACTTCTAGG ACTTCTAGG ACTTCTAGG Das Sequenzmotiv kann zwei bis mehrere zehn Basen lang sein und hunderte oder auch hunderttausende Male wiederholt werden. Große Anhäufungen von Tandemwiederholungen im Genom (einfacher Chromosomensatz) bezeichnet man als Satelliten-DNA . Diese kann einen beträchtlichen Anteil eukaryontischer (Eukaryoten = Lebewesen mit Zellkern und Cytoskelett) Genome ausmachen und ist wichtigste Ursache des C-Wertparadoxons (gibt die Menge der DNA im einfachen Chromosomensatz an). Tandemwiederholungen sind besonders in eukaryontischen Organismen verbreitet und haben hier eine wichtige Funktion, indem sie zum Beispiel für die Aufrechterhaltung der Struktur der Chromosomen sorgen. Tandemwiederholungen dienen oft auch als Erkennungsmotiv für DNA-bindende oder -verändernde Proteine. Sie sind jedoch von Palindromsequenzen (doppelsträngige DNA - Sequenzen) zu unterscheiden.

6 Fingerabdruck

7 Mutagenese Die Mutagenese ist die Erzeugung von Mutationen im Erbgut von Lebewesen. Mutation: Eine Mutation (lat. mutare verändern) ist eine Veränderung des Erbgutes eines Organismus durch Veränderung der Abfolge der Nucleotidbausteine oder durch Veränderung der Chromosomenzahl. Durch eine Mutation wird die in der DNA gespeicherte Information verändert und dadurch können einzelne Merkmale verändert werden. In der biologischen und medizinischen Forschung sowie in der Züchtung wird die Mutagenese eingesetzt, um erwünschte Eigenschaften zu erreichen. Dazu werden die zu züchtenden Organismen mutagenen, d.h. erbgutverändernden Bedingungen, ausgesetzt. Diese reichen von der Bestrahlung mit ionisierender Strahlung bis zum Einsatz chemischer Stoffe. Ionisierende Strahlung: Strahlung wird als Ionisierende Strahlung bezeichnet, wenn sie in der Lage ist, Atome oder Moleküle zu ionisieren, d. h. aus diesen Elektronen zu entfernen Bei der gezielten Mutagenese werden einzelne Nukleotide an einer definierten Stelle in einem Gen ausgetauscht.

8 Erbkrankheiten Die Erkennung von Erbkrankheiten in einem vorliegenden Genom ist ein langwieriger und komplizierter Vorgang, der durch den Einsatz von PCR bedeutend verkürzt werden kann. Jedes Gen, das in Frage kommt, kann durch PCR mit den entsprechenden Primern amplifiziert (= vervielfältigt) und anschließend sequenziert werden (DNA sequenzieren heißt, die Sequenz der Nukleotide (oder Basen) der DNA zu bestimmen), um Mutationen aufzuspüren. Virale Erkrankungen können ebenfalls durch PCR erkannt werden, indem man die Virus-DNA vervielfältigt. Diese Analyse kann sofort nach der Infektion erfolgen, oft Tage oder Wochen vor dem Auftreten der Symptome. Erfolgt die Diagnose so früh, erleichtert das den Medizinern die Behandlung erheblich. Die PCR kann auch zu Reihenuntersuchungen eingesetzt werden. So wird sie z.B. von Blutspendediensten zur Routineuntersuchung von Blutkonserven eingesetzt. Durch die frühestmögliche Entdeckung einer gefährlichen Infektionskrankheit beim Spender (z.B. HIV, Hepatitis B) kann das sog. diagnostische Fenster nahezu geschlossen werden. Durch die Empfindlichkeit der PCR-Tests ist es möglich, Proben in sog. Pools (z.B. 96 Einzelproben) zusammenzufassen. Wird ein Pool positiv getestet, wird seine Größe solange verkleinert (meistens halbiert), bis die verursachende Probe gefunden ist.

9 Vaterschaftstest DNA-Analyse mittels PCR-Methode (Polymerase-Ketten-Reaktion) Zu allererst werden DNA-Proben der betreffenden Personen benötigt. Die Genauigkeit des Tests ist am höchsten, wenn Proben vom Kind, Vater, und der Mutter vorliegen. Normalerweise werden diese DNA-Proben mittels Mundschleimhautabstrichen gewonnen. Dies erfolgt ganz schmerzlos mit Hilfe von Wattestäbchen. Geringe Mengen der DNA werden isoliert und anschließend mit der Polymerase-Kettenreaktion vervielfältigt. In diesen DNA-Abschnitten sind sogenannte Repititivsequenzen enthalten. Diese sind in Form von mehrfach wiederholten Einheiten aufgebaut. Die verschiedenen Merkmalsausprägungen (Allele) dieser Sequenzen werden anschließend analysiert und miteinander verglichen. Alle Eigenschaften und Fähigkeiten einer Person, die durch ein oder eine Kombination von Genen bestimmt werden, nennt man Allel. Gibt es zum Beispiel ein Gen das bestimmt, ob jemand die Zunge rollen kann oder nicht, so ist die Fähigkeit des Zungenrollens oder Nichtrollens das Allel dieses Gens. Bei einem Kind sind jeweils die Hälfte der Merkmalsausprägungen von der Mutter und die andere Hälfte vom Vater. Um eine Vaterschaft nachzuweisen, muss das Kind bei allen Allelen, die nicht mit der Mutter übereinstimmen, dies mit dem Vater tun.

10 Klonierung