Beate Bulawa, Jost Liebich

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1 Beate Bulawa, Jost Liebich
Forschungszentrum Jülich Institut für Chemie und Dynamik der Geosphäre IV: Agrosphäre TP 2.3: Umsatz von Maisstroh in Mikrokosmen nach Behandlung mit Benazolin und Benzoapyren - Komplexe mikrobielle Gemeinschaften und Isolierung prozessrelevanter Mikroorganismen Beate Bulawa, Jost Liebich  Title

2 Aufgaben PA2 FZ Jülich Forschungszentrum Jülich
Beate Bulawa, Jost Liebich ICG IV: Agrosphäre

3 Besonderheiten der Mikrokosmen
Mikroorganismen: komplexe Gemeinschaft bzw. definierte Gemeinschaft Boden: nativ (Typische Parabraunerde) bzw. geglüht (frei von organischem C) Ernterückstände: natives Maisstroh 14C-Maisstroh Xenobiotika: Benazolin Benzo[a]pyren Besonderheiten der Mikrokosmen Natronkalk –Falle zur Fixierung von 14CO2 Boden Forschungszentrum Jülich Beate Bulawa, Jost Liebich ICG IV: Agrosphäre

4 Aufgabe 1: Kurzfristiger Umsatz von Maisstroh durch komplexe mikrobielle Gemeinschaften
Fragestellung: Werden die Struktur und die Funktion der mikrobiellen Gemeinschaften während des Maisstrohumsatzes durch die Xenobiotika Benazolin und Benzoapyren in verschiedenen Konzentrationen beeinflusst? Ansatz: 6-Wochen-Versuch mit Benazolin (0, 1, 10 und 50 ppm)in geglühtem und nativem Boden Bestimmung von: Mikrobieller Aktivität (DMSO-Reduktase-Raten) Mineralisierung von 14C-markiertem Maisstroh Boden-pH Forschungszentrum Jülich Beate Bulawa, Jost Liebich ICG IV: Agrosphäre

5 Ergebnisse Über den Versuchszeitraum war keine Hemmung der mikrobiellen Aktivität durch Benazolin zu erkennen. Die Mineralisierung von 14C-Maisstroh wurde nur zu Beginn und bei Einsatz von 50 ppm Benazolin gehemmt. Forschungszentrum Jülich Beate Bulawa, Jost Liebich ICG IV: Agrosphäre

6 Analytik: - Abbaustudien in Boden-Mikrokosmen
Forschungszentrum Jülich ICG IV: Agrosphäre Vorversuch Ziel: Einfluss von Benazolin- Herbizides auf die mikrobielle Aktivität im Boden Analytik: - Abbaustudien in Boden-Mikrokosmen - DMSO-Raduktase-Rate - pH-Wert-Messung Komponenten des Versuches: 1. Geglühter Boden (steril) / Frischboden (jew. 250 g) 2. Maisstroh (tw. 14C-markiert; 1 g / 100 g Boden) Komplexe mikrobielle Gemeinschaft in Form einer Bodensuspension (1 ml /100 g Boden) 4. Benazolin Einsatz: 1 mg kg-1, 10 mg kg-1 und 50 mg kg-1 zusätzlich Kontrolle ohne Benazolin 5. ~ 40 % Wkmax 6. Inkubationszeit: 6 Wochen

7 Forschungszentrum Jülich ICG IV: Agrosphäre
Die Methode beruht auf der folgenden 2-Elektronen-Transfer-Reaktion: (CH3)2SO + 2H+ (CH3)2S + H2O DMSO DMS Die Messung erfolgte mittels eines Gaschromatographs nach 3 Std.-iger Inkubation bei 40°C mit einer 10%-igen DMSO-Lösung (w/v)

8 Forschungszentrum Jülich ICG IV: Agrosphäre
Glasrohr Quarzwolle Natronkalk Erlenmeyerkolben geglühter Boden/ Frischboden

9 Forschungszentrum Jülich ICG IV: Agrosphäre
Versuch-Teil I: Ziel/Fragestellung: Wird das Verhalten der mikrobiellen Gemeinschaften im Boden, die am Umsatz von pflanzlicher abgestorbener Biomasse beteiligt sind, durch die ausgewählten Xenobiotika beeinflusst? Komponenten des Versuches: Geglühter Boden + Maisstroh (teilweise 14C- markiert) + komplexe mikrobielle Gemeinschaft (Bodensuspension) Nativer + Maisstroh Benazolin 50 ppm Benzo[a]pyren 1 ppm Benazolin 200 ppm Benzo[a]pyren 50 ppm Benzo[a]pyren 200 ppm KONTROLLE mit der Maisstroh-Zugabe aber ohne Xenobiotika - Bodenfeuchte 40 % Wkmax, - Inkubationszeit 90 Tage, KONTROLLE ohne Maisstroh

10 Vorgesehene Analyse: Mineralisierung von 14C-markiertem Maisstroh,
Forschungszentrum Jülich ICG IV: Agrosphäre Forschungszentrum Jülich ICG IV: Agrosphäre Vorgesehene Analyse: Mineralisierung von 14C-markiertem Maisstroh, DMSO-Reduktase-Rate, Analyse der mikrobiellen Gemeinschaft mittels DGGE Quantitative Biomasse Bestimmung (DNA-Gehalt und/oder Fluoreszenz-Mikroskopie) Pilzliche Biomasse (Ergosterol- Gehalt) pH-Messung, Bildung von Huminstoffen: Gelpermeationschromatographie (GPC), flüssige NMR

11 Forschungszentrum Jülich ICG IV: Agrosphäre
Die Methode beruht auf der folgenden 2-Elektronen-Transfer-Reaktion: (CH3)2SO + 2H+ (CH3)2S + H2O DMSO DMS Die Messung erfolgte mittels eines Gaschromatographs nach 3 Std.-iger Inkubation bei 40°C mit einer 10%-igen DMSO-Lösung (w/v)

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Glasrohr Quarzwolle Natronkalk Erlenmeyerkolben geglühter Boden/ Frischboden

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Die Methode beruht auf der folgenden 2-Elektronen-Transfer-Reaktion: (CH3)2SO + 2H+ (CH3)2S + H2O DMSO DMS Die Messung erfolgte mittels eines Gaschromatographs nach 3 Std.-iger Inkubation bei 40°C mit einer 10%-igen DMSO-Lösung (w/v)

14 Forschungszentrum Jülich ICG IV: Agrosphäre
Glasrohr Quarzwolle Natronkalk Erlenmeyerkolben geglühter Boden/ Frischboden

15 Veränderung der mikrobiellen Diversität
Forschungszentrum Jülich ICG IV: Agrosphäre Veränderung der mikrobiellen Diversität bei der Humifizierung von Ernterückständen unter dem Einfluss von Xenobiotika Zusammensetzung der mikrobiellen Gemeinschaft Analyse von DNA Quantitative Biomasse Bestimmung Extraktion von 16S rDNA Amplifikation geeigneter Sequenzen durch PCR DNA-Gehalt/PCR-Produkt-Bestimmung mittels Flureszenz-Spektroskopie z.B. mit PicoGreen (Molekular Probes)- einem dsDNA-Fluoreszenz-Farbstoff Auftrennung mit Hilfe der denaturierenden Gradienten Gelelektrophorese (DGGE) (Bandenmuster von PCR-Produkten)

16 Quantifizierung der extrahierten DNA mittels Fluoreszenz-Spektroskopie
Forschungszentrum Jülich ICG IV: Agrosphäre Quantifizierung der extrahierten DNA mittels Fluoreszenz-Spektroskopie Vorteile des PicoGreen-Farbstoffes: sehr sensibler, spezifische für die dsDNA Fluoreszenz-Farbstoff, ermöglicht die Quantifizierung von DNA im Bereich zwischen 25 pg / ml und 1 µl /ml, Messung erfolgt bei 480 nm Anregung und 520 nm Emission

17 Veränderung der DGGE-Bandenmuster
Forschungszentrum Jülich ICG IV: Agrosphäre Veränderung der DGGE-Bandenmuster bei der Humifizierung von Ernterückständen unter dem Einfluss von Benazolin nach 14 Tagen 30 % denat. Agens BK B50 B200 Bandenmuster der eingesetzten mikrobiellen Gemeinschaft im geglühten Boden nach 14 Tagen Inkubation. BK: Kontrolle (geglühter Boden ohne Benazolin) B50: Boden mit Benazolin Konzentration 50 ppm B200: Boden mit Benazolin Konzentration 200 ppm Quantifizieren der extrahierten DNA mittels Fluoreszenz-Spektroskopie Laufrichtung der DGGE X X X X 70 % denat. Agens Keine Bande = X

18 Veränderung der DGGE-Bandenmuster
Forschungszentrum Jülich ICG IV: Agrosphäre Veränderung der DGGE-Bandenmuster bei der Humifizierung von Ernterückständen unter dem Einfluss von Benazolin nach 49 Tagen 30 % denat. Agens BK B50 B200 Bandenmuster der eingesetzten mikrobiellen Gemeinschaft im geglühten Boden nach 49 Tagen Inkubation. BK: Kontrolle (geglühter Boden ohne Benazolin) B50: Boden mit Benazolin Konzentration 50 ppm B200: Boden mit Benazolin Konzentration 200 ppm 2 3 1 Quantifizieren der extrahierten DNA mittels Fluoreszenz-Spektroskopie Laufrichtung der DGGE 70 % denat. Agens

19 Veränderung der DGGE-Bandenmuster
Forschungszentrum Jülich ICG IV: Agrosphäre Veränderung der DGGE-Bandenmuster bei der Humifizierung von Ernterückständen unter dem Einfluss von Benazolin nach 14 und 49 Tagen 30 % denat. Agens BK1 B50/1 B200/1 A B C Bandenmuster der eingesetzten mikrobiellen Gemeinschaft im geglühten Boden nach 14 Tagen Inkubation. BK1: Kontrolle (geglühter Boden ohne Benazolin) B50/1: Boden mit Benazolin Konzentration 50 ppm B200/1: Boden mit Benazolin Konzentration 200 ppm Bandenmuster nach 49 Tagen: A: Kontrolle (geglühter Boden ohne Benazolin) B: Boden mit Benazolin Konzentration 50 ppm C: Boden mit Benazolin Konzentration 200 ppm Laufrichtung der DGGE 70 % denat. Agens

20 Veränderung der DGGE-Bandenmuster
Forschungszentrum Jülich ICG IV: Agrosphäre Veränderung der DGGE-Bandenmuster bei der Humifizierung von Ernterückständen unter dem Einfluss von Benzo-a-pyren nach 14 Tagen 30 % denat. Agens BK B50 B200 BapK Bap1 Bap50 Bap200 Bandenmuster der eingesetzten mikrobiellen Gemeinschaft im geglühten Boden nach 14 Tagen Inkubation. BapK: Kontrolle (ohne Benzo-a-pyren) Bap1: Boden mit Benzo-a-pyren Konzentration 1 ppm Bap50: Boden mit Benzo-a-pyren Konzentration 50 ppm Bap200: Boden mit Benzo-a-pyren Konzentration 50 ppm Keine (X) Quantifizieren der extrahierten DNA mittels Fluoreszenz-Spektroskopie Laufrichtung der DGGE X X X schwach X 70 % denat. Agens

21 Veränderung der DGGE-Bandenmuster
Forschungszentrum Jülich ICG IV: Agrosphäre Veränderung der DGGE-Bandenmuster bei der Humifizierung von Ernterückständen unter dem Einfluss von Benzo-a-pyren nach 49 Tagen 30 % denat. Agens Bandenmuster der eingesetzten mikrobiellen Gemeinschaft im geglühten Boden nach 49 Tagen Inkubation. BapK: Kontrolle (ohne Benzo-a-pyren) Bap1: Boden mit Benzo-a-pyren Konzentration 1 ppm Bap50: Boden mit Benzo-a-pyren Konzentration 50 ppm Bap200: Boden mit Benzo-a-pyren BapK Bap1 Bap50 Bap200 2 1 Keine (X) Laufrichtung der DGGE Quantifizieren der extrahierten DNA mittels Fluoreszenz-Spektroskopie X X X schwach X 70 % denat. Agens

22 Veränderung der DGGE-Bandenmuster
Forschungszentrum Jülich ICG IV: Agrosphäre Veränderung der DGGE-Bandenmuster bei der Humifizierung von Ernterückständen unter dem Einfluss von Benzo-a-pyren nach 14 und 49 Tagen A A1 B B1 C C1 D D1 30 % denat. Agens Bandenmuster der eingesetzten mikrobiellen Gemeinschaft im geglühten Boden nach 14 Tagen Inkubation. A: BapK: Kontrolle (ohne Benzo-a-pyren) B: Bap1: Boden mit Benzo-a-pyren Konzentration 1 ppm C: Bap50: Boden mit Benzo-a-pyren Konzentration 50 ppm D: Bap200: Boden mit Benzo-a-pyren Bandenmuster nach 49 Tagen: A1: Kontrolle (ohne Benzo-a-pyren) B1: Boden mit Benzo-a-pyren C1: Boden mit Benzo-a-pyren D1: Boden mit Benzo-a-pyren Laufrichtung der DGGE 70 % denat. Agens

23 Charakterisierung der pilzlichen Dynamik
Forschungszentrum Jülich ICG IV: Agrosphäre Charakterisierung der pilzlichen Dynamik bei der Humifizierung von Ernterückständen Molekularbiologische Analyse: Extraktion von 18S rDNA Bandenmuster von partiell amplifizierter 18S rDNA nach Auftrennung mittels denaturierender Gradienten Gelelektrophorese Pilzliche Biomasse: Ergosterol- Extraktion die Extraktion erfolgt mit Hexan, Quantifizierung über Eichstandards mittels Hochleistungs-Flüssigchromatographie (HPLC)

24 Aufgabe 2: Definierte Gemeinschaften
Boden- Mikrokosmen mit Bodenprobe Kultivierung nativen Gemeinschaften Isolierung definierten Gemeinschaften Bodenisolate Charakterisierung anhand physiologischer Profile und 16S bzw. 18S rDNA-Sequenzdaten Forschungszentrum Jülich Beate Bulawa, Jost Liebich, ICG IV: Agrosphäre

25 Aufgabe 2: Definierte Gemeinschaften
Fragestellung: Identifizierung von Mikroorganismen, die am Umsatz von Maisstroh beteiligt sind und in den Modell-Mikrokosmen mit definierten Gemeinschaften eingesetzt werden können (Aufgabe 3) Methodik: Extraktion von DNA aus allen Isolaten Charakterisierung des DGGE-Laufverhaltens der amplifizierten DNA Identifizierung von Doppelisolaten (z.B. mit ERIC- oder BOX-Fingerprint) Vergleich der DGGE-Bandenmuster ausgewählter Bodenproben mit dem DGGE-Laufverhalten der amplifizierten Isolate-DNA Bestätigung gleicher Identitäten durch Sequenzierung einzelner Banden Mikrobiologische Charakterisierung Analytik von Laccase- und Protease-Bildung der Isolate Forschungszentrum Jülich Beate Bulawa, Jost Liebich, ICG IV: Agrosphäre

26 Zeitplan Forschungszentrum Jülich
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27 Planungen Charakterisierung der Bodenisolate
Mikrokosmos-Versuche in geglühtem und nativem Boden mit Benazolin und Benzo[a]pyren in verschiedenen Konzentrationen mit begleitender Analytik der mikrobiellen Gemeinschaften. Einsatz definierter Gemeinschaften in den Abbauversuchen. Untersuchung der Humifizierungsprozesse in Bodensäulen Forschungszentrum Jülich Jost Liebich, Beate Bulawa ICG IV: Agrosphäre

28 Zeitplan (Antrag) Jahr: Kurzfristiger Umsatz von Maisstroh in Mikrokosmen mit definierten und komplexen Gemeinschaften in geglühtem Boden Untersuchung der mikrobiellen und physikochemischen Dynamik Jahr: Mikrokosmen mit definierten Gemeinschaften in nativem Boden und/oder Einsatz verschiedener Ernterückstände Untersuchung der mikrobiellen und physikochemischen Dynamik Jahr: Bodensäulenversuche zur Validierung des Modellsystems Untersuchung der mikrobiellen und physikochemischen Dynamik Einsatz der Xenobiotika Benazolin und/oder Benzoapyren Forschungszentrum Jülich Jost Liebich, Beate Bulawa ICG IV: Agrosphäre

29 Zeitplan (Juli 2001) Jahr: Kurzfristiger Umsatz von Maisstroh in Mikrokosmen nur mit komplexen mikrobiellen Gemeinschaften in geglühtem und nativem Boden Einsatz der Xenobiotika Benazolin und/oder Benzoapyren Charakterisierung prozessrelevanter Bodenisolate Jahr: Mikrokosmen mit definierten Gemeinschaften in nativem Boden (Umsatz von Maisstroh) Jahr: Validierung der Mikrokosmen Untersuchung der mikrobiellen und physikochemischen Dynamik Einsatz der Xenobiotika Benazolin und/oder Benzoapyren Forschungszentrum Jülich Jost Liebich, Beate Bulawa ICG IV: Agrosphäre