Fraktionierung Aufreinigung des Grün Fluoreszierenden Proteins (GFP) aus einem E.-coli-Lysat durch Säulenchromatographie

Sicherheitshinweis Beim Arbeiten mit der UV- Lampe muss eine Schutzbrille getragen werden!!!

1. Vorbereitungen zur Säulen- chromatographie Aufgabe 1: Prüfen Sie ihr Tube mit dem E.-coli-Lysat im UV-Feld auf Fluoreszenz. Notieren Sie ihre Beobachtungen!

1.1 Zentrifugieren Sie das Zelllysat 10 min. bei rpm. 1. Vorbereitungen zur Säulen- chromatographie TE-PufferÜberstand

1.2 Schütteln Sie die Säule um das Säulen- material zu durchmischen. 1.3Warten Sie etwa 2 min. bis sich das Säulenmaterial abgesetzt hat. 1.4Öffnen Sie die Chromatographie- säule zunächst oben, dann unten. 1. Vorbereitungen zur Säulen- chromatographie

1.5Lassen Sie die Flüssigkeit in der Säule vollständig heraustropfen. 1.6 Pipettieren Sie 2 ml Ausgleichspuffer (AP) an der Wand entlang in die Säule. 1.7Lassen Sie den Ausgleichspuffer bis zur 1 ml-Markierung durch die Säule laufen. 1.8Verschließen Sie die Säule. (Unten gelben Verschluss benutzen!) 1. Vorbereitungen zur Chromatographie

1.9 Entnehmen Sie Ihr Tube aus der Zentrifuge. Aufgabe 2: Prüfen Sie Ihr Tube mit dem zentrifugierten E. coli-Lysat im UV-Feld auf Fluoreszenz ohne das Pellet aufzuwirbeln! Notieren Sie Ihre Beobachtung! 1.10Pipettieren Sie in Ihr gelbes Tube, das 250 µl Bindepuffer (BP) enthält, 250 µl Überstand des Bakterienlysats. 1. Vorbereitungen zur Säulen- chromatographie

2.1 Nummerieren Sie Ihre Sammel- röhrchen. 2.2 Öffnen Sie die Chromatographie- säule und lassen Sie die Säule leer laufen. 2.3Stecken Sie die Säule auf Sammelröhrchen 1 um. 2. Durchführung der Säulen- chromatographie

2.4 Pipettieren Sie 250 µl des ver- dünnten Bakterienlysats aus dem gelben Tube BP an der Wand entlang in die Säule. 2.5Lassen Sie die Säule leer laufen. Legen Sie beim Einpipettieren die Spitze der Pipette an den oberen Rand der Säule an.

2. Durchführung der Säulen- chromatographie Aufgabe 3: Prüfen Sie Ihre Chroma- tographiesäule im UV- Feld auf GFP- Fluoreszenz. Notieren Sie ihre Beobachtungen!

2.6 Stecken Sie die Säule auf Sammelröhrchen 2 um. 2.7 Pipettieren Sie 250 µl Wasch- puffer (WP) an der Wand entlang in die Säule. 2. Durchführung der Säulen- chromatographie

Aufgabe 4: Prüfen Sie Ihre Chroma- tographiesäule im UV- Feld auf GFP- Fluoreszenz. Notieren Sie ihre Beobachtungen!

2.8Stecken Sie die Säule um auf das Sammel- röhrchen Pipettieren Sie 750 µl Elutions- puffer (EL) in die Säule. 2. Durchführung der Säulen- chromatographie Hinweis: Unter Beobachtung der Elution im UV-Feld kann GFP in hoher Konzentration fraktioniert werden, indem die Säule, sobald GFP austropft, auf ein neues Sammel- röhrchen umgesteckt wird.

2. Durchführung der Säulen- chromatographie Aufgabe 5: Prüfen Sie Ihre Chroma- tographiesäule während der Elution im UV-Feld auf GFP-Fluoreszenz. Notieren Sie ihre Beobachtungen!

Die Fraktionen in den Sammelröhrchen werden in entsprechend beschriftete Tubes umgefüllt und bis zur Reinheitsprüfung mittels Polyacrylamid-Gelelektrophorese bei –18°C aufbewahrt. Aufbewahrung der Fraktionen bis zur Reinheitsprüfung

Reinigung: Die Säule wird mit 2 ml 70%-tigem Ethanol nachgespült. Aufbewahrung: Die Säule wird mit 2 ml 20%-tigem Ethanol versetzt und kann so bei Raumtemperatur aufbewahrt werden. 3. Reinigung und Aufbewahrung der Chromatographiesäulen