Agarosegelelektrophorese

Präsentation zum Thema: "Agarosegelelektrophorese"—  Präsentation transkript:

1 Agarosegelelektrophorese
Eine sehr wichtige Analysentechnik für Nukleinsäuren

2 Sie lernen ... das Prinzip, Nukleinsäuren zu analysieren
DNA anzufärben DNA zu quantifizieren

3 Problem Die Länge eines DNA-Moleküls kann in weiten Grenzen schwanken:
Chromosom: 2 x 108 bp chromosomale DNA aus einem Bakterium oder Virus: 4 x 106 bp Plasmid-Moleküle: 1 x 104 bp Fragmente eines Restriktionsverdaus: 3 x 103 bp PCR-Produkte: 1 x 103 bp Primer/Oligos: 20 nt

4 Lösung Elektrisches Feld Setzt geladene Moleküle voraus
DNA ist wegen der Phosphatgruppen negativ geladen (Anion) DNA wandert also zur Anode (Plus-Pol) „Poren“ in der Trennmatrix sieben die Moleküle nach ihrer Größe

5 Und noch ein Problem DNA ist farblos
Wie kann die DNA „sichtbar“ gemacht werden? Durch Färbung: z.B. mit Ethidiumbromid Achtung: der Farbstoff muss die DNA erkennen. Weil der Farbstoff mit der DNA eine Wechselwirkung eingehen muss, kann er für unser Genom „gefährlich“ sein.

6 1. Schritt Lösen Sie 0,8 g Agarose in 98 ml demin. Wasser und 2 ml 50-fache TAE- Stammlösung Kochen Sie die Suspension auf, bis sie aufklart. Hinweise: Die Agarose-Menge bestimmt die Porosität der Trennmatrix. Je höher die Agarosemenge, desto kleiner die Poren, desto kleinere DNA-Fragmente können getrennt werden. Achten Sie auf einen möglichen Siederverzug beim Aufkochen der Agarose.

7 2. Schritt Gießen Sie die etwa 60°C heiße Agarose in die waagerecht liegende Gelkammer. Setzen Sie den Kamm in die Gelkammer. Lassen Sie die Agarose erkalten. Hinweise: Die Agarose wird fest, wenn sie abkühlt. Dabei trübt sich das Gel ein. Die Agarose kann im Trockenschrank bei 60°C wochenlang flüssig gehalten werden. Achten Sie auf eine waagerecht liegende Gelkammer, damit das Gel gleichmäßig dick wird. Ungleichmäßige Gele liefern ungleichmäßige Trennungen.

8 3. Schritt Überschichten Sie das Gel etwa 3 mm mit Trenngelpuffer (1x-TAE) Ziehen Sie den Kamm aus den Probetaschen. Achten Sie darauf, dass die Probetaschen gleichmäßig mit Puffer voll laufen.

9 4. Schritt Mischen Sie Ihre DNA-Proben mit Auftragepuffer, z.B. 5 µl Plasmidlösung mit 1 µl 6x Probenauftragepuffer. Bringen Sie Ihre DNA-Proben in die Probentaschen. Tragen Sie in der 1. und in der letzten Spur einen geeigneten DNA-Längenstandard auf. Hinweise: siehe nachfolgende Folie

10 Hinweise zum Probenauftrag
Mischen Sie die Proben auf einem Stück Parafilm. Auf dessen hydrophober Oberfläche bleiben die Lösungen als leicht mischbare Tropfen stehen. Der Auftragepuffer enthält einen oder zwei Farbstoffe: Bromphenolblau und eventuell Xylencyanol. Bromphenolblau zeigt die Front der wandernden Anionen. Der Auftragepuffer erhöht die Dichte Ihrer Probelösung. Damit wird ein Aufschwimmen der Probe in der Probentasche verhindert. Notieren Sie unbedingt die Reihenfolge Ihrer Proben und deren Probevolumen.

11 Probenauftrag Tragen Sie in die flankierenden Probetaschen den DNA-Längestandard auf. Sie können die Länge der DNA in ihren Proben daran referenzieren.

12 5. Schritt Schließen Sie die Spannungsquelle an die Gelkammer an.
Legen Sie eine Spannung von bis zu 7 Vcm-1 Elektrodenabstand an. Das elektrische Feld wird erst abgestellt, wenn die Bromphenolblaufront das Gelende erreicht hat. Hinweise: Bei 15 cm Elektrodenabstand werden maximal 120 V angelegt. Bromphenolblau wandert in einem 0,8%-igen Gel wie etwa 400 bp lange DNA.

13 6. Schritt Entnehme Sie mit einem Spatel das Agarosegel aus der Gelkammer. Färben Sie das Gel mit einem Farbstoff Ihrer Wahl in einer Färbekammer. Hinweis: Farbstoffe, die DNA anfärben, können gesundheitsschädlich sein. Beachten Sie die Sicherheitshinweise zu dem von Ihnen eingesetzten Farbstoff.

14 Färbung mit Ethidiumbromid
Mischen Sie 1 µl einer 1%-igen Ethidiumbromidstammlösung mit 100 ml 1x-TAE Puffer. Inkubieren Sie das Gel für 5-10 min in diesem Färbebad. Legen Sie es auf einen Transilluminator (302 oder 312 nm) Hinweise: siehe nachfolgende Folie!

15 Hinweise zur EtBr-Nutzung
Tragen Sie unbedingt Handschuhe (Latex oder Nitril)! Das Färbebad sollte an einer gesicherten Stelle stehen. Es darf nur unter Lehreraufsicht benutzt werden. Das EtBr-Färbebad kann wochenlang lichtgeschützt bei Raumtemperatur aufbewahrt werden. Sie können das Gel bei Bedarf nachfärben.

16 7. Schritt Dokumentieren Sie das Ergebnis Ihrer Analyse mit einer digitalen Kamera. Beschriften Sie in einem Bildbearbeitungsprogramm die Banden des verwendeten Längenstandards.