Praktikum ELISA Modellexperiment zum Nachweis einer HIV-Infektion durch den Nachweis von Antikörpern im Blutserum.

Präsentation zum Thema: "Praktikum ELISA Modellexperiment zum Nachweis einer HIV-Infektion durch den Nachweis von Antikörpern im Blutserum."—  Präsentation transkript:

1 Praktikum ELISA Modellexperiment zum Nachweis einer HIV-Infektion durch den Nachweis von Antikörpern im Blutserum

2 Antikörpernachweis prinzipieller Ablauf Antigene binden an die Festphase Noch freie Oberfläche der Festphase wird blockiert Zugabe des auf Antikörper zu unter- suchenden Blutserums Enzym gekoppelter Antikörper bindet an Epitop des evtl. vorhandenen Antikörpers Nachweis der Infektion wird durch eine Enzymreaktion erbracht

3 Vorbereitungen zum Experiment für den Lehrer

4 Waschpuffer (900 ml) 805 ml H 2 O dest. + 90 ml PBS (10-fach) + 4,5 ml Tween 20 Waschpuffer wird zum Verdünnen der Antikörperstammlösung und zum Waschen der Mikrotiterstreifen benötigt. Tween 20 enthält BSA zum Blockieren der freien Festphasenoberfläche. 1. Ansetzen der Pufferlösungen PBS-Puffer (100 ml) 90 ml H 2 O dest. + 10 ml PBS (10-fach) PBS-Puffer wird zum Rehydratisieren der lyophilisierten Antigene und Antikörper benötigt.

5 2. Rehydratisieren Pipettieren Sie jeweils 0,5 ml ver- dünnten PBS-Puffer zum lyophilisierten Antigen sowie zum primären- bzw. sekundären Antikörper! Alle Stammlösungen sind 50-fach konzentriert! Entfernen Sie vorsichtig die Stopfen der Antikörpergefäße und des Anti- gengefäßes! Verschließen Sie die Gefäße mit den Stopfen und schütteln Sie etwa 2 Minuten! (Stammlösungen) !

6 3. Beschriftung Beschriften Sie je zwei Polyethylen- Spritzflaschen mit: - Antigen - Primärer Antikörper - Sekundärer Antikörper Antigen

7 Vorbereitungen zum Experiment durch die Schüler Vorbereitungen zum Experiment durch die Schüler in 8 Arbeitsgruppen Die Chemikalien reichen für die dreimalige Durchführung des Praktikums mit jeweils 8 Arbeitsgruppen! (3 x 160 µl Stammlösung = 480 µl; bei 500 µl Gesamtvolumen)

8 Tubeübersicht Tube- farbe Beschrif- tung InhaltMenge Grün“AG“Antigen800 µl Orange“sAK“Sekundärer enzymgekoppelter Antikörper 800 µl Braun“SUB“Substrat800 µl Violett“pAK“Primärer Antikörper120 µl Blau“WP“Waschpuffer120 µl Gelb - Noch leer!

9 1. Probenvorbereitung P1 – P8 -Beschriften Sie die 8 gelben Tubes mit Ihrer Gruppen- nummer! -Pipettieren Sie jeweils 60 µl primärer Antikörper (positives Testergebnis) oder 60 µl Waschpuffer (negatives Testergebnis) in alle 8 gelben Tubes (P1 – P8 entsprechen den Serumproben)! -Verteilen Sie je 1 Tube an die acht Arbeitsgruppen! !

10 FarbeBeschrif- tung InhaltMenge Grün“AG“Antigen800 µl Orange“sAK“ Sekundärer enzymgekoppelter Antikörper 800 µl Braun“SUB“Substrat800 µl Violett“pAK“Primärer Antikörper120 µl Blau“WP“Waschpuffer120 µl GelbP1 – P8„Blutserum“ Proben 1 - 8Je 60 µl Komplette Tubeübersicht (Testbeginn)

11 2. Durchführung des Tests

12 2.1 Antigenbindung an den Mikrotiterstreifen Beschriften Sie einen Mikrotiterstreifen entsprechend der folgenden Abbildung! Pipettieren Sie jeweils 50 µl Antigenlösung (AG, aus dem grünen Tube) in alle 12 Kammern! Inkubieren Sie 5 Minuten! + + - - P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8

13 Experiment im Überblick HIV-Antigene binden an die Festphase

14 2.2 Waschen des Mikrotiterstreifens! Klopfen Sie den Streifen auf Papiertüchern aus! Pipettieren Sie 250 µl Waschpuffer in jede Kammer! Achtung! Beim Pipettieren darf der Waschpuffer nicht in die Nachbarkammern gelangen! Klopfen Sie den Streifen auf neuen Papiertüchern aus!

15 Experiment im Überblick HIV-Antigene binden an die Festphase Die noch freie Oberfläche der Festphase wird durch BSA, enthalten im Waschpuffer, blockiert

16 Positiv-Kontrolle: Pipettieren Sie jeweils 50 µl Antikörperlösung (pAK, aus dem violetten Tube) in die zwei mit “+“ beschrifteten Kammern! 2.3 Ansetzen der Kontrollen Negativ-Kontrolle: Pipettieren Sie 50 µl Waschpuffer (WP, aus dem blauen Tube) in die zwei mit “-“ beschrifteten Kammern! + + - - P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 Ak WP

17 2.3 Ansetzen der Proben Inkubieren Sie 5 Minuten! Ansetzen Proben: Pipettieren Sie jeweils 50 µl der „Serumproben“ P1 – P8 in die entsprechend beschrifteten 8 Kammern! („Serumzugabe“) + + - - P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8

18 Experiment im Überblick HIV-Antigene binden an die Festphase Noch freie Oberfläche der Festphase wird blockiert Zugabe des auf Antikörper zu untersuchenden Blutserums

19 2.4 Waschen des Mikrotiterstreifens (siehe 2.2 ) Ausklopfen+ 250 µl WPAusklopfen

20 2.5 Zugabe des sekundären Antikörpers Inkubieren Sie 5 Minuten! Pipettieren Sie jeweils 50 µl der sekundären Antikörperlösung (sAK, aus dem orange- farbenen Tube) in alle 12 Kammern!

21 Experiment im Überblick Antigene binden an die Festphase Noch freie Oberfläche der Festphase wird blockiert Zugabe des auf Antikörper zu unter- suchenden Blutserums Enzym gekoppelter Antikörper bindet an Epitop des evtl. vorhandenen Antikörpers

22 Ausklopfen+ 250 µl WPAusklopfen 2.6 Zweimaliges Waschen des Mikrotitersteifens (siehe 2.2 )

23 2.7 Substratzugabe Inkubieren Sie 5 Minuten! Pipettieren Sie jeweils 50 µl Substratlösung (SUB, aus dem braunen Tube) in alle 12 Kammern!

24 Antikörpernachweis prinzipieller Ablauf Antigene binden an die Festphase Noch freie Oberfläche der Festphase wird blockiert Zugabe des auf Antikörper zu unter- suchenden Blutserums Enzym gekoppelter Antikörper bindet an Epitop des evtl. vorhandenen Antikörpers Nachweis der Infektion wird durch eine Enzymreaktion erbracht

25 3. Auswertung Positive Proben sind blau gefärbt, negative Proben bleiben farblos (siehe Kontrollen) Kontrollieren Sie Ihre Versuchsergebnisse (P1 – P8) in den jeweiligen Arbeits- gruppen! + + - - P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 z.B.: