Bestimmung der Molaren Masse vom Grün fluoreszierenden Protein (GFP)

Präsentation zum Thema: "Bestimmung der Molaren Masse vom Grün fluoreszierenden Protein (GFP)"—  Präsentation transkript:

1 Bestimmung der Molaren Masse vom Grün fluoreszierenden Protein (GFP)

2 1. Ansetzen der Proben für die Polyacrylamid-Gelektrophorese (PAGE)
1.1 Pipettieren Sie 20 µl aus den Tubes BL, W1, E1 und E2 in neue, gleich beschriftete Tubes 2

3 1. Ansetzen der Proben für die PAGE
1.1 Pipettieren Sie 10 µl Lämmli-Puffer zu den Proben in die neuen Tubes. 1.2 Durchmischen Sie Ihre Probentubes durch Anschnippen.

4 2. Vorbereiten der Gelkassette
2.1 Schneiden Sie die Verpackung des Fertiggels entlang der vor- gegebenen Linie auf und ent- nehmen Sie die Gelkassette.

5 2. Vorbereiten der Gelkassette
2.2 Schneiden Sie mit einem Skalpell die Klebefolie der Gelkassette entlang der markierten unteren Linie ein und ziehen Sie den unteren Streifen ab.

6 Vorbereiten der Kammer

7 3. Vorbereiten der Elektrophorese-kammer
3.1 Setzen Sie die Gelkassette mit der kürzeren Platte nach innen gerichtet in den Elektrodenstand ein. Setzen Sie auf der gegenüberliegenden Seite eine weitere Gelkassette oder eine Blindplatte ein. 3.2 Drücken Sie den Elektrodenstand im Klammer- rahmen nach unten und schließen Sie die Klemmklappen.

8 3. Vorbereiten der Elektrophorese-kammer
3.3 Setzen Sie den Klammerrahmen mit dem Elektrodenstand in den Pufferbehälter ein.

9 4. Befüllen der Kammer mit Puffer
4.1 Befüllen Sie den Elektrodenstand mit TGS-Puffer bis zum oberen Rand. 4.2 Befüllen Sie den Pufferbehälter mit etwa 200 ml TGS-Puffer. 4.3 Ziehen Sie vorsichtig den Kamm.

10 5. Befüllen der Geltaschen
Füllen das Gel Folgendermaßen: 1: 10 µl Kaleidoskop-Proteinstandard (KS) 2: 20 µl Bakterien Lysat (BL) 3: 20 µl Waschen 1 (W1) 4: 20 µl Eluat (E1) 5: 20 µl Eluat (E2) Die zweite Gruppe füllt in die Taschen 6 – 10 in der selben Reihenfolge.

11 6. Durchführung der Elektrophorese
6.1 Schließen Sie die Gelkammer und starten Sie die Gelelektrophorese bei 200 V. 6.2 Die Elektrophorese wird beendet, wenn das Bromphenolblau den unteren Rand des Gels erreicht hat.

12 7. Entnahme des Gels 7.1 Entnehmen Sie den Klammerrahmen aus dem Pufferbehälter und dekantieren Sie den Puffer in den Pufferbehälter ab. (Puffer ist wieder verwendbar) 7.2 Entnehmen Sie die Gelkassette aus dem Elektrodenstand.

13 8. Auswertung 8.1 Markieren Sie die GFP-Bande im UV- Feld.

14 8. Auswertung 8.2 Ermitteln Sie die Molare Masse von GFP anhand des Kaleidoskop-Standards Farbe kDa Blau 250 kDa Violett 150 kDa 100 kDa Magenta 75 kDa 50 kDa Grün 37 kDa 25 kDa 20 kDa 15 kDa Gelb 10 kDa Tab.: Molare Masse der Proteine im Kaleidoskop-Standard

15 9. Removal of the gel 9.1 Öffnen Sie die Gelkassette und überführen Sie das Gel in eine leere Färbeschale. 9.2 Waschen Sie das Gel 2 Minuten mit Wasser ab. 9.3 Färben Sie das Gel für 15 Minuten in 100 ml Coomassie-Lösung.

16 9. Protein staining 9.4 Schütten Sie die Coomassie-Lösung zurück in die Vorratsflasche. Entfärben Sie das Gel in 100 ml lauwarmen Wasser (ggf. über Nacht)

17 10. Discussion of the results
Diskutieren Sie den Effekt der Aufreinigung durch die Chromatographie und leiten sie Schlussfolgerungen ab.