Praktikum I Immunpräzipitation.

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1 Praktikum I Immunpräzipitation

2 Ablauf des Experiments
Ablaufplan

3 1. Experimentvorbereitung
1.1 Herstellen der Antikörper-Arbeitslösung Die AK-Stammlösung enthält 7,5 mg IgG/mL (Gesamtvolumen: 1mL) Pipettieren Sie 100 µL Antikörper-Stammlösung aus dem gelben Tube (AK-Stamm) in Ihr rotes Probetube (AK) Pipettieren Sie nun 900 µL NaCl-Lösung in das rote Tube (AK) Durchmischen Sie anschließend die Lösung durch mehrfaches Auf- und Abpipettieren der Lösung Beim Durchmischen nur bis zum ersten Anschlag pipettieren, sonst entstehen Luftblasen!

4 1. Experimentvorbereitung
1.2 Herstellen der Antigen-Arbeitslösung Die Konzentration der AG-Stammlösung beträgt 50 mg/mL (Gesamtvolumen: 1 mL) Pipettieren Sie 40 µl aus dem violetten Tube (AG-Stamm) in das blaue Tube (AG) Pipettieren Sie nun 960 µL NaCl-Lösung in das blaue Tube (AG) Durchmischen Sie anschließend die Lösung durch mehrfaches Auf- und Abpipettieren

5 2. Ansetzen der Verdünnungsreihe
2.1 Pipettieren Sie in die Wells 1 – 7 jeweils 100 µl NaCl Lösung. 2.2 Pipettieren Sie 200 µL AG-Arbeitslösung aus dem blauen Tube in Well 8. 200 µL AG 8 7 6 5 4 3 2 1

6 2. Ansetzen der Verdünnungsreihe
2.3 Pipettieren Sie 100 µL AG aus Well 8 in Well 7. 2.4 Durchmischen Sie den Inhalt von Well 7 durch mehrfaches Auf- und Abpipettieren. Beim Durchmischen nur bis zum ersten Anschlag pipettieren, sonst entstehen Luftblasen! 200 µL AG 8 7 6 5 4 3 2 1

7 2. Ansetzen der Verdünnungsreihe
2.5 Pipettieren Sie aus Well µL in Well 6. 2.6 Durchmischen Sie den Inhalt von Well 6 durch mehrfaches Auf- und Abpipettieren. Verfahren Sie entsprechend bis zu Well 1. 2.7 Verwerfen Sie nun 100 µL aus Well 1. 100 µL 100 µL 100 µL 100 µL 100 µL 100 µL 100 µL verwerfen 8 7 6 5 4 3 2 1

8 2. Ansetzen der Verdünnungsreihe
2.8 Pipettieren Sie in alle Wells jeweils 100 µL AK aus dem roten Tube. 2.9 Inkubieren Sie Ihren Ansatz 5 Minuten bei Raumtemperatur. Welche AG-Konzentration liegt nun in den verschiedenen Wells vor?

9 Praktikum II Antikörper-Analytik

10 1. Ansetzen der Proben für die PAGE
Bereiten Sie Ihre Tubes nach folgendem Pipettierschema vor.

11 1. Ansetzen der Proben für die PAGE
1.1 Pipettieren Sie aus dem grünen Tube (LÄ) jeweils 25 µL Lämmlipuffer in die Probentubes 1-9. 1.2 Pipettieren Sie jeweils 15 µL H2O in die Tubes 1, 2, 4, 5, 7 und 8, jeweils 5 µL H2O in die Tubes 3, 6 und 9. 1.3 Durchmischen Sie den Inhalt von Well 4 durch mehrfaches Auf- und Abpipettieren. Pipettieren Sie aus Well µL Präzipitat in die Probentubes 1, 2 und 3. 1.4 Pipettieren Sie aus dem roten Tube (AK) 10 µL Antikörper in die Probentubes 4, 5 und 6. 11

12 1. Ansetzen der Proben für die PAGE
1.4 Pipettieren Sie aus dem blauen Tube (AG) 10 µL Antigen in das Probentube 7, 8 und 9. 1.5 Pipettieren Sie aus dem gelben Tube (DTT) jeweils 10 µL Dithiotreitol in die Probentubes 3, 6 und 9.

13 1. Ansetzen der Proben für die PAGE
1.6 Stellen Sie die Probentubes 2, 3, 5, 6, 8 und für 5 min bei 95° C in einen Heizblock. Tube Hitze DTT AK/AG 1 - 2 + 3 AK 4 5 6 AG 7 8 9

14 2. Vorbereiten der Gelkassette
2.1 Schneiden Sie die Verpackung des Fertiggels entlang der vorgegebenen Linie auf und entnehmen Sie die Gelkassette. 14 14

15 2. Experimentvorbereitung
2.2 Schneiden Sie mit einem Skalpell die Klebefolie der Gelkassette entlang der markierten Linie ein und ziehen Sie den unteren Streifen ab. 15 15

16 3. Vorbereiten der Elektrophoresekammer
3.1 Setzen Sie die Gelkassette mit der kürzeren Platte nach innen gerichtet in den Elektrodenstand ein. Setzen Sie auf der gegenüberliegenden Seite eine weitere Gelkassette oder eine Blindplatte ein. 3.2 Drücken Sie den Elektrodenstand im Klammer- rahmen nach unten und schließen Sie die zwei Klemmklappen. 3.3 Setzen Sie den Klammerrahmen mit dem Elektrodenstand in den Pufferbehälter ein. 16

17 4. Befüllen der Kammer mit Puffer
4.1 Befüllen Sie den Elektrodenstand mit TGS-Puffer bis zum oberen Rand. 4.2 Befüllen Sie den Pufferbehälter mit etwa 800 mL TGS-Puffer. 4.3 Ziehen Sie den Kamm. (Einkerbung beachten!) 17 17

18 5. Befüllen der Geltaschen
Befüllen Sie die Geltaschen mit: - 20 µL aus Probentube (1) - 20 µL aus Probentube (2) - 20 µL aus Probentube (3) - 5 µLKaleidoskop-Längenstandard (KS) - 20 µL aus Probentube (4) - 20 µL aus Probentube (5) - 20 µL aus Probentube (6) - 20 µL aus Probentube (7) - 20 µL aus Probentube (8) - 20 µL aus Probentube (9) AK/AG KS AK AG 18

19 6. Durchführung der Elektrophorese
6.1 Schließen Sie die Gelkammer und starten Sie die Gelelektrophorese bei 150 V. 6.2 Beenden Sie die Elektrophorese, wenn der Farbstoff den unteren Rand des Gels erreicht hat. 19

20 7. Entnahme des Gels 7.1 Entnehmen Sie den Klammerrahmen und dekantieren Sie den Puffer in den Pufferbehälter ab. (Puffer ist wiederverwendbar!) 7.2 Entnehmen Sie die Gelkassette aus dem Elektrodenstand. 20

21 8. Proteinfärbung 8.1 Lösen Sie die Glasplatten vom Gel und legen Sie dieses in eine Färbeschale. 8.2 Vor dem Färben das Gel 2 Minuten wässern, dann Wasser dekantieren. 8.3 Färben Sie das Gel durch Zugabe von 100 mL Coomassie-Lösung maximal 30 Minuten. 8.4 Gießen Sie anschließend die Coomassie-Lösung in die Vorratsflasche zurück und fügen Sie 100 mL lauwarmes Wasser hinzu. 8.5 Stellen Sie das Gel auf den Schüttler.

22 Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor
9. Auswertung 9.1 Erstellen Sie eine Eichgerade mit Hilfe des Kaleidoskop-Standard. Tab.: Molare Masse der Proteine im Kaleidoskop-Standard Protein Farbe M Myosin Blau Da ß-Galactosidase Magenta Da Rinderalbumin Grün 83559 Da Karbonanhydrase Violett 39559 Da Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor Orange 31405 Da Lysozym Rot 17408 Da Aprotinin 7081 Da 22

23 9. Auswertung 9.2 Bestimmen Sie die molekularen Massen der Banden
jeder Spur. Welche Bande gehört zu welchem Protein?