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Immunologie in der Labormedizin Konteptvorlesung 2 Themenblock 8 Beda M. Stadler Einige der Folien werden als Illustration verwendet und sind nicht Lernstoff.

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1 Immunologie in der Labormedizin Konteptvorlesung 2 Themenblock 8 Beda M. Stadler Einige der Folien werden als Illustration verwendet und sind nicht Lernstoff. Sie sind so wie hier entweder orange unterlegt oder umrandet Diese Folien stehen auch als PPT Files zum download bereit unter:

2 KV 8.22 KV2 im Überblick Was sind Immunassays? Was versteckt sich hinter den Abkürzungen? Assay Beispiele um immunologische Prinzipien zu vertiefen Aussagekraft von Labordaten Vertrauensgrenzen Lernziele: Immunologie in der Labormedizin

3 KV 8.23 Was ankreuzen?

4 KV 8.24 KV3 im Überblick Präzipitationsteste Agglutinations Teste Antigen-Antikörper Teste Allgemein Allergie Diagnostik Flowzytometrie HLA Diagnostik Autoimmun Diagnostik Sensitivität und Spezifität von Labortesten Immunologie in der Labormedizin

5 KV 8.25 Identität 1 A Partielle Identität 1 A Keine Identität 1 A Immunodiffusion (Ouchterlony Gel) A 1 2 Antigen Kontrollserum Testserum

6 KV 8.26 Antigen Präzipitinkurve + Anti-A Anti-B Anti-C C B A AntikörperImmunkomplex Antigen ProzonePostzone Äquivalenz

7 KV 8.27 Radiale Immunodiffusion AK Konzentration Diameter 2 Ag Antikörper im Gel

8 KV 8.28 Serum Elektrophorese gamma beta alpha2 alpha1 Albumin - + Globuline Paraproteinämie-Patient

9 KV 8.29 Immun-Elektrophorese IgAAlbuminTransferrinIgGIgM + Normales Serum Patienetenserum mit IgA Mangel Antikörper gegen Serumproteine - Beispiel

10 KV Direkter Coombs Test

11 KV Der indirekte Coombs Test Patienten Serum Erythrozyten +  Step 1 +  Coombs Reagens (Antiglobulin) Step 2 z.B. anti-RhD Antikörper

12 KV Passive Hämagglutination (Beispiel: Anti-Syphilis Antikörper)

13 KV Latex Agglutination

14 KV Blutgruppenbestimmung: Geltechnik Resultat: Blutgruppe A RhD neg monoklonaler Antikörper gegen Blutgruppen A Antigen in der oberen Gelmatrix

15 KV z.B. Schwangerschaftstest rapid determination of human chorionic gonadotropin (hCG) in urine specimens Primary antibodies (anti-hCG labelled or on solid phase) Secondary antibodies (anti-Ig on solid phase)

16 KV Allergieserologie: welcher Test? Anti-  2-Glycoprotein 1 (IgG) ELISAU/ml<15 Cardiolipin-Antikörper (IgG)SYNELISAGPL-U/ml<12 ECP ("eosinophil cationic protein")FEIA  g/L TryptaseFEIA  g/L MethylhistaminRIAµg/g Kreatinin Total IgEFEIAkIU/L(altersabhängig) Allergen-spezifisches IgE (RAST) FEIARastklassen 0-60 Allergen-spezifisches IgGFEIAmg/L< 50 mg/L PräzipitineImmundiffusionqualitativnegativ AnalyseMessprinzipMasseinheit Referenz- bereich

17 KV 8.217

18 KV Isotop Enzyme Messung der RadioaktivitätoderEnzymaktivität Immun Assay: RIA & ELISA Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay AntikörperAntigen markierterAntikörper Radio Immuno Assay

19 KV ELISA Anti-A Markierter Antikörper A Enzym Substrat Produkt

20 KV Sandwich ELISA Anti-A Anti-Antikörper A Enzym Substrat Produkt

21 KV Standardisierung

22 KV Beispiel: Flowzytometrie Analyse MessprinzipMasseinheitReferenzbereich HLA-B27 Zytofluorometrie qualitativ positiv/negativ Lymphozyten Zytofluorometrie Zellen/  l CD3 absolut Zytofluorometrie Berechnung Zellen/  l % der Lymphozyten CD4 absolut Zytofluorometrie Berechnung Zellen/  l % der Lymphozyten CD8 absolut Zytofluorometrie Berechnung Zellen/  l % der Lymphozyten NK-Zellen Zytofluorometrie Berechnung Zellen/  l % der Lymphozyten B-Zellen Zytofluorometrie Berechnung Zellen/  l % der Lymphozyten

23 KV sample red fluorescence sorted cells sheet flow nozzle laser forward scatter right angle scatter green fluorescence prism FACS Fluorescence Activated Cell Sorter Fluorescence Activated Cell Sorter

24 KV Zellpopulationen Link alle CD Marker alle CD Marker ?

25 KV CD-Antikörper CD Antigen FunktionVorkommen CD 2 Rezeptor für CD 58 (LFA-3), alternativer Aktivierungsweg von T-Lymphozyten unreife und reife T-lymphozyten CD 3 T-Zell-Rezeptor-assoziierte polypeptidketten, Signaltransduktion reife T-Lymphozyten CD 4 assoziative Erkennungsstruktur (Bindung an MHC-Klasse II Moleküle), HIV-Rezeptor T-Helferzellen, Monozyten, Makrophagen CD 8 Bindung an MHC-Klasse I Molekülezytotoxische T-Lymphozyten CD 14 Rezeptor für bakterielles Endotoxin (LPS=Lipopolysacharid) Monozyten, Makrophagen CD 16 Fc-gamma Rezeptor III NK-Zellen, Monozyten-Subpopulationen, Makrophagen CD 23 niedrig affiner (bindender) Rezeptor für IgEB-Lymphos, follikuläre dendritische Zellen (=FDC) CD 25 Interleukin-2-Rezeptoraktivierte T-Lymphozyten IgM Antigenrezeptorunreife + reife B-Lymphos IgD Antigenrezeptorreife B-Lymphos HLA-DR MHC-Klasse II Moleküle, Bindung von Antigenpeptiden AG-präsentierende Zellen (dendritische Zellen, Monozyten, B-Zellen), aktivierte T-Lymphos

26 KV Eine Immunantwort verfolgen

27 KV CD-Marker bei der Diagnose von lymphohämopoietischen Erkrankungen StammzellePrä-B.frühe B.mittlere B.reife B.plasmozytoide B.Plasmazelle ALL PLL, Burkitt Lymphom CLL, foll. L. Haarzell- L. WaldenströmMyelom CD19 CD 20 CD 34 CD 52 CD13 8

28 KV Beispiel: HLA Typisierung

29 KV HLA Typisierung einst...

30 KV Überlebensrate Nierentransplantate Number of HLA mismatches A & B DQ & DR 0 0 A & B DQ & DR 3 or 4 1 or 2

31 KV HLA-B27 Typisierung mittels FACS

32 KV HLA Typisierung serologisch

33 KV PCR

34 KV HLA: Molekulare Diagnostik

35 KV Array Technologie „DNA Chips“

36 KV Western Blot: Prinzip

37 KV HIV: Western Blot 1.Lane 1, HIV+ serum (positive control) 2.Lane 2, HIV- serum (negative control) 3.Lane A, Patient A 4.Lane B, Patient B 5.Lane C, Patient C 1.Lane 1, HIV+ serum (positive control) 2.Lane 2, HIV- serum (negative control) 3.Lane A, Patient A 4.Lane B, Patient B 5.Lane C, Patient C

38 KV Beispiel: Autoimmunserologie Analyse Messprinzip MasseinheitReferenzbereich RheumafaktorNephelometrieIU/ml< 20 Zellkerne (ANA)IIFTiter< 1:80 Thyreoidea ThyroglobulinAgglutinationTiter< 1:400 C1-Esteraseinhibitor (funktionell)Fotometrie% des Normwertes70-130% C1q-tragende ImmunkomplexeELISA  g/ml < 35 HautbiopsieDIFqualitativnegativ SchleimhautbiopsieDIFqualitativnegativ

39 KV Nephelometry

40 KV Immunfluoreszenz Antinukleäre Antikörper (ANA) Ag Fluorochrom markierter AK Gewebe

41 KV Maus Lymphknoten gefärbt mit einem anti-T-Zell Antikörper

42 KV In situ Hybridisierung

43 KV FISH

44 KV FISH Beispiel Fluorescent in situ hybridisation of a small intestinal biopsy in a case of Whipple's disease (confocal laser scanning microscopy). Tropheryma whipplei rRNA is blue, nuclei of human cells are green and the intracellular cytoskeletal protein vimentin is red. Magnification approximately 200 x.

45 KV Immunhistochemie Human Papillomavirus DNA demonstrated by In Situ Hybridisation (pink) in epithelial cells identified by indirect immunofluorescence using antibody against cytokeratin (green)

46 KV Sensitivität und Spezifität Sensitivität (epidemiologisch) Sensitivität (analytisch) niedriger Titer Serokonversion Verdünnung

47 KV oder... Sensitivität = Wahrscheinlichkeit, dass Test bei kranken Personen positiv ausfällt Spezifität = Wahrscheinlichkeit, dass Test bei gesunden Personen negativ ausfällt

48 KV Genauigkeit der Labordiagnostik X 100% echt Positive echt Positive + falsch Negative Sensitivität = X 100% echt Negative echt Negative + falsch Positive Spezifität =

49 KV Aussagekraft der Labordiagnostik echt Positive + falsch Positive echt Positive X 100% positiver prädiktiver Wert = echt Negative + falsch Negative echt Negative X 100% negativer prädiktiver Wert =

50 KV Prädiktive Werte Population #1, die Prävalenz der Infektion ist hoch Population: 1000 Seren getestet 50 Seren von infizierten Individuen 950 Seren von nicht infizierten Individuen Test Results: 50 positive: 45 aus der infizierten Gruppe 5 falsch positive aus der nicht infizierten Gruppe Der positive prädiktive Wert ist: PPV = 45/ 45+5 = 90% 9 von 10 positiven Resultaten sind von infizierten Individuen Annahme: Test Sensitivität = 100% / Spezifität = 99.5%

51 KV Prädiktive Werte Population #2, die Prävalenz der Infektion ist tief Population: 1000 Seren getestet 7 Seren von infizierten Individuen 993 Seren von nicht infizierten Individuen Test Results: 7 positive: 2 aus der infizierten Gruppe 5 falsch positive aus der nicht infizierten Gruppe Der positive prädiktive Wert ist: PPV = 2/ 2+5 = 28.6% Annahme: Test Sensitivität = 100% / Spezifität = 99.5%

52 KV KV2 im Rückblick Immunologie in der Labormedizin Traditionelle Serologie Moderne immunologische Teste Molekularbiologische Methoden Outlook: Point-of-care testing ? Immunologie Wahlpraktikum 3. Studienjahr 2004 „Ein Einblick in die Labormedizin“


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