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Molekularbiologischer Metastasen- nachweis beim Prostatakarzinom (PCa) Dr. U. Fiedler Urologisches Forschungslabor Klinik und Poliklinik für Urologie Universitätsklinikum.

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Präsentation zum Thema: "Molekularbiologischer Metastasen- nachweis beim Prostatakarzinom (PCa) Dr. U. Fiedler Urologisches Forschungslabor Klinik und Poliklinik für Urologie Universitätsklinikum."—  Präsentation transkript:

1 Molekularbiologischer Metastasen- nachweis beim Prostatakarzinom (PCa) Dr. U. Fiedler Urologisches Forschungslabor Klinik und Poliklinik für Urologie Universitätsklinikum der TU-Dresden

2 Metastasierung beim PCa Ansiedlung in: Lymphknoten 69 % Knochen 68% Lunge 48% Leber 33% Ausbreitung über: Lymphbahnen peripheres Blut Eble 1993

3 Diagnose der Metastasierung Prä-operativ: Prä-operativ:Tumormarkerbestimmung (PSA) Bildgebende Verfahren (Knochenszintigraphie, PET, CT, MRT, Immunszintigraphie) Post-operativ: Post-operativ:Histopathologische Begutachtung (Gewebe) Immunhistochemie (anti-PSA-Antikörper)

4 Partin-Tabelle zur Beurteilung des Lymphknotenbefalls, PSA >20 ng/ml klinisches Tumorstadium Partin 1997

5 Partin-Tabelle zur Beurteilung des Lymphknotenbefalls, PSA 10,1-20 ng/ml klinisches Tumorstadium Partin 1997

6 Partin-Tabellen zur Beurteilung des Lymphknotenbefalls Partin 1997 Wahrschein- lichkeit % Gleason- score klinisches Tumorstadium PSA ng/ml PSA >20 ng/ml

7 PSA-Serumwerte und pathologische Skelettszintigraphie Oesterling 1993

8 Sensitivität des Lymphknoten- Stagings Beer 1992 Lamb 1998

9 Entwicklung molekularbiologischer Techniken Nachweis von Tumorzellen im Blut, Knochenmark und Lymphknoten ZIEL: ZIEL: Verbesserte Diagnostik der Metastasierung bei unterschiedlichen PSA-Werten Verbesserte Diagnostik des entnommenem LK- Gewebes gegenüber der Histopathologie Verbesserte Verlaufskontrolle gegenüber der Bestimmung von Serum-PSA

10 Möglichkeiten des Nachweises von PCa-Zellen Nachweisebenen DNA mRNA Proteine

11

12 Molekularbiologische Marker und Techniken für das PCa Cytokeratin PSA, PSMA Amplifikation von Chr. 7 Deletionen von 13q, 10q, 16q Immunzytologie, FACS, Immunomagnetische Separation RT-PCR FISH, Allelverlust- analysen, GCH mRNA Proteine DNA Techniken verwendete Marker

13 Molekularbiologische Verfahren und Marker für das PCa prostataspezifisch: PSA, PSM, DD3 tumorspezifisch: Telomerase, PTI chrom. Zugewinne: Chromosom 7, 8 Tumorsuppressorgene E-cadherin beim Metastasierung: KAI-1 PTEN Allelverluste:8p, 10q, 16q Verfahren RT-PCR FISH/GCH LOHs differentielle Genexpressionsmuster Marker

14 Immunomagnetische Tumorzellanreicherung Erhöhung der Sensitivität des Nachweises durch Anreicherung Positivselektion (anti-epithelialer-AK) Negativselektion (panleukozytärer-AK CD45)

15 Immunzytologische Nachweistechniken Immunzytologie FACS Immunomagn. Sepa. FITC S P E

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17 Untersuchung von chromosomalen Veränderungen von Tumorzellen im Blut und Knochenmark (FISH, GCH) Universitätsklinikum Dresden bei 85% der Pca-zellen im Knochenmark wurden chromosomale Aneusomien (z. b. tri- oder tetrasomie der Chromosomen 7 und 8 nachgewiesen.

18 Untersuchungen zu LOHs im Blut und Plasma

19 Universitätsklinikum Dresden Nachweis von spezifischen Transkripten mittels RT-PCR Isolierung der Mononukleären Blutzellpopulation Dichtegradientenzentrifugation evtl. Konzentrierung über magnetic beads Zellaufschluß Isolierung der Gesamt-RNA Umschreibung in cDNA Transkript-spezifische PCR

20 Universitätsklinikum Dresden Probleme der RT-PCR AAA mRNA cDNA PCR AAA TTT Kontroll-PCR: GAPDH Primerauswahl Spezifität

21 Nachweis spezifischer Transkripte mittels RT-PCR Isolierung und Aufschluß der Leukozyten-Fraktion Aufschluß des Lymphknoten- Gewebes Isolierung der Gesamt-RNA Umschreibung in cDNA Transkript-spezifische PCR AAA mRNA cDNA PCR AAA TTT

22 Entwicklung eines Testsystems basierend auf der RT- PCR Primerauswahl: Primerauswahl: Exonübergreifend (DNA-Verunreinigung) keine Homologien zu anderen Transkripten Kontroll-PCRs: Kontroll-PCRs: für RNA-Qualität und -Präparation sowie cDNA-Synthese standardisierte pos. und neg. Kontrollen Reaktionsprodukte: Reaktionsprodukte: Spezifitätsprüfung durch Sequenzierung, Hybridisierung oder Hybridisierungsproben Quantifizierung: Quantifizierung: on line in der log. Phase der PCR Exon

23 Nachweis disseminierter PCa-Zellen im Blut PSA/PSMA -RT-PCR keine eindeutige Korrelation zwischen RT-PCR und Metastasierung

24 Das Prostata Spezifische Membranantigen (PSM) extr. cyt.

25 Nachweis von PCa-Zellen im Knochenmark Wood 1994

26 Nachweis von PCa-Zellen in regionären Lymphknoten Universitätsklinikum Dresden Sensitivität: 75 %Spezifität 87 %

27 Zusammenfassung Methoden: Methoden: RT-PCR, Immunzytologie Marker: Marker:prostata-bzw. tumorzellspezifisch Korrelationen: Korrelationen: Histopathologie - RT-PCR (LK) Tumorstadium - RT-PCR (Knochenmark) Probleme: Probleme:spezifische Marker

28 Mitarbeiter des urologischen Forschungslabors Prof. Dr. M. P. Wirth Dr. Ulrike Fiedler Wibke Ehlers Birgit Noack Ascan Schindler Jörg Stade Romy Kranz Jana Scholze Silke Strangfeld Astrid Bergmann Universitätsklinikum Dresden


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