Molekularbiologischer Metastasen-nachweis beim Prostatakarzinom (PCa)

Präsentation zum Thema: "Molekularbiologischer Metastasen-nachweis beim Prostatakarzinom (PCa)"—  Präsentation transkript:

1 Molekularbiologischer Metastasen-nachweis beim Prostatakarzinom (PCa)
Dr. U. Fiedler Urologisches Forschungslabor Klinik und Poliklinik für Urologie Universitätsklinikum der TU-Dresden 1 1

2 Metastasierung beim PCa
Ausbreitung über: Lymphbahnen peripheres Blut Ansiedlung in: Lymphknoten 69 % Knochen 68% Lunge 48% Leber 33% Eble 1993 2 2

3 Diagnose der Metastasierung
Prä-operativ: Tumormarkerbestimmung (PSA) Bildgebende Verfahren (Knochenszintigraphie, PET, CT, MRT, Immunszintigraphie) Post-operativ: Histopathologische Begutachtung (Gewebe) Immunhistochemie (anti-PSA-Antikörper) 3

4 Partin-Tabelle zur Beurteilung des Lymphknotenbefalls, PSA >20 ng/ml
klinisches Tumorstadium Partin 1997

5 Partin-Tabelle zur Beurteilung des Lymphknotenbefalls, PSA 10,1-20 ng/ml
klinisches Tumorstadium Partin 1997

6 Partin-Tabellen zur Beurteilung des Lymphknotenbefalls
PSA ng/ml PSA >20 ng/ml Wahrschein- lichkeit % Gleason- score klinisches Tumorstadium Partin 1997 4

7 PSA-Serumwerte und pathologische Skelettszintigraphie
Oesterling 1993 5

8 Sensitivität des Lymphknoten-Stagings
Beer 1992 Lamb 1998 6

9 Entwicklung molekularbiologischer
Techniken Nachweis von Tumorzellen im Blut, Knochenmark und Lymphknoten ZIEL: Verbesserte Diagnostik der Metastasierung bei unterschiedlichen PSA-Werten Verbesserte Diagnostik des entnommenem LK- Gewebes gegenüber der Histopathologie Verbesserte Verlaufskontrolle gegenüber der Bestimmung von Serum-PSA 7

10 Möglichkeiten des Nachweises von PCa-Zellen
Nachweisebenen DNA mRNA Proteine 4 8

11

12 Molekularbiologische Marker und Techniken für das PCa
verwendete Marker Techniken Cytokeratin PSA, PSMA Amplifikation von Chr. 7 Deletionen von 13q, 10q, 16q Proteine Immunzytologie, FACS, Immunomagnetische Separation RT-PCR FISH, Allelverlust- analysen, GCH mRNA DNA 9

13 Molekularbiologische Verfahren und Marker für das PCa
RT-PCR FISH/GCH LOH’s differentielle Genexpressionsmuster Marker prostataspezifisch: PSA, PSM, DD3 tumorspezifisch: Telomerase, PTI chrom. Zugewinne: Chromosom 7, 8 Tumorsuppressorgene E-cadherin beim Metastasierung: KAI-1 PTEN Allelverluste: 8p, 10q, 16q 4

14 Immunomagnetische Tumorzellanreicherung
Erhöhung der Sensitivität des Nachweises durch Anreicherung Positivselektion (anti-epithelialer-AK) Negativselektion (panleukozytärer-AK CD45)

15 Immunzytologische Nachweistechniken
Immunzytologie FACS Immunomagn. Sepa. FITC E S P 10

16

17 Untersuchung von chromosomalen Veränderungen von Tumorzellen im Blut und Knochenmark (FISH, GCH)
bei 85% der Pca-zellen im Knochenmark wurden chromosomale Aneusomien (z. b. tri- oder tetrasomie der Chromosomen 7 und 8 nachgewiesen. Universitätsklinikum Dresden 16

18 Untersuchungen zu LOH’s im Blut und Plasma

19 Nachweis von spezifischen Transkripten mittels RT-PCR
Isolierung der Mononukleären Blutzellpopulation Dichtegradientenzentrifugation evtl. Konzentrierung über magnetic beads Zellaufschluß Isolierung der Gesamt-RNA Umschreibung in cDNA Transkript-spezifische PCR Universitätsklinikum Dresden 6

20 Probleme der RT-PCR Kontroll-PCR: GAPDH Primerauswahl Spezifität AAA
mRNA AAA TTT cDNA AAA PCR Kontroll-PCR: GAPDH Primerauswahl Spezifität Universitätsklinikum Dresden

21 Nachweis spezifischer Transkripte
mittels RT-PCR Isolierung und Aufschluß der Leukozyten-Fraktion Aufschluß des Lymphknoten- Gewebes AAA Isolierung der Gesamt-RNA Umschreibung in cDNA Transkript-spezifische PCR AAA mRNA AAA TTT cDNA AAA PCR 6 11

22 Entwicklung eines Testsystems basierend auf der RT- PCR
Primerauswahl: Exonübergreifend (DNA-Verunreinigung) keine Homologien zu anderen Transkripten Kontroll-PCR‘s: für RNA-Qualität und -Präparation sowie cDNA-Synthese standardisierte pos. und neg. Kontrollen Reaktionsprodukte: Spezifitätsprüfung durch Sequenzierung, Hybridisierung oder Hybridisierungsproben Quantifizierung: on line in der log. Phase der PCR Exon 12

23 Nachweis disseminierter PCa-Zellen im Blut
PSA/PSMA -RT-PCR keine eindeutige Korrelation zwischen RT-PCR und Metastasierung 9 13

24 Das Prostata Spezifische Membranantigen (PSM)
extr. cyt.

25 Nachweis von PCa-Zellen im Knochenmark
Stadium Patienten Mikrometastasen % pos. Knochen- Metastasen 14 100 pos. LK-Metastasen 9 7 77 organbegrenzt 31 29 organüberschreitend 32 20 63 gesamt 86 50 58 BPH 25 Wood 1994 14 14

26 Nachweis von PCa-Zellen in regionären Lymphknoten
Sensitivität: 75 % Spezifität 87 % Universitätsklinikum Dresden 15

27 Zusammenfassung Methoden: RT-PCR, Immunzytologie
Marker: prostata-bzw. tumorzellspezifisch Korrelationen: Histopathologie - RT-PCR (LK) Tumorstadium - RT-PCR (Knochenmark) Probleme: spezifische Marker 16

28 Mitarbeiter des urologischen Forschungslabors
Prof. Dr. M. P. Wirth Dr. Ulrike Fiedler Wibke Ehlers Birgit Noack Ascan Schindler Jörg Stade Romy Kranz Jana Scholze Silke Strangfeld Astrid Bergmann Universitätsklinikum Dresden