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1 Role of λ5 in B Cell Development Kitamura et al. 1992 Supplemental Material.

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Präsentation zum Thema: "1 Role of λ5 in B Cell Development Kitamura et al. 1992 Supplemental Material."—  Präsentation transkript:

1 1 Role of λ5 in B Cell Development Kitamura et al Supplemental Material

2 2 Homologe Rekombination Zielgen Neo Wildtype Deletions- vektor Rekombi- nierter Lokus TK HSV

3 3 Acyclovir (Zovirax®) Acyclovir, ein Purinanalog, hat hohe Affinität zu viraler TK Acyclovir wird durch Thymidinkinase phos- phoryliert und als Nukleotidanalog in DNA eingebaut DNA Elongation wird terminiert Struktur Wirkungsmechanismus

4 4 Selektion gegen zufällige Integration Zielgen Neo TK HSV Neo Homologe Rekombination Neo + TK HSV - Neo TK HSV Zufällige Insertion des gesamten Vektors Neo + TK HSV + Neo TK Zufällige, partielle Insertion des Vektors Neo + TK HSV -

5 5 Homologe Rekombination Zielgen Neo Wildtype Deletions- vektor Rekombi- nierter Lokus

6 6 Konstruktion des λ 5 Deletions-Vektor neo Deletions- vektor Wildtyp- Lokus Kloniertes Fragment Promoter-Deletion neo Neo- Insertion Vektor

7 7 Homologe Rekombination neo Deletions- vektor Wildtyp- Lokus neo Deletierter Lokus PCR

8 8 Knockout Mäuse Blastozyteninjektion

9 9 Chimäre Agouti-Maus Main Entry: agou·ti Pronunciation: &-'gü-tE Function: noun Etymology: French, from Spanish agutí, from Tupi Date: : any of a genus (Dasyprocta) of tropical American rodents about the size of a rabbit 2 : a grizzled color of fur resulting from the barring of each hair in several alternate dark and light bands Chimäre Mäuse

10 10 Southernblotanalyse von Maus-DNA EcoRI neo 12 EcoRI Sonden

11 11 Von der chimären zur hetero- und homozygoten Knockout-Maus Chimäre Maus Rag2 -/- C57Bl6 Rag2 -/- F1 (nicht nach Mendel)

12 12 Oberflächenmarker zur Bestimmung des Differenzierungsstadiums D J H V H DJ H Späte Pro-B- Zelle Späte Prä-B- Zelle Unreife B-Zelle Frühe Prä-B- Zelle Stamm- zelle Frühe Pro-B- Zelle V J IgM B220 Reife B-Zelle IgD Große Zellen Kleine Zellen

13 13 Blut Milz +/+ -/+ -/- Milz Lymphozyten in Blut und Milz

14 14 B-lymphoide Zellen im Knochenmark

15 15 Analyse der λ 5-KO-Maus Wolfgang Schuh (Jäck Lab)

16 16 Bedeutung des Prä-B-Zellrezeptor für die Entwicklung B-lymphoider Vorläuferzellen Stamm- Prä-Pro- Pro- Frühe Prä- Späte Prä- Unreife Reife Plasma- Zelle B-Zelle B-Zelle B-Zelle B-Zelle B-Zelle B-Zelle zelle CD19 c-kit CD25 D J H V H DJ H V L J L IgM IgD RAG -/- Ig µ m -/- 5 -/- VpreB -/- µ Dys -/- J H -/- ) µ Prä-BZR B220 (CD45)

17 17 Bl/6 WTRag2 KO 5 KO (7weeks) CD19 C-kit CD25 IgM BM 14,170,097,56 27,372,28,7 25, ,4

18 18 Bl/6 WTRag2 KO 5 KO (7weeks) CD19 IgM CD4 CD8 Spleen 47,70,116,6

19 19 Serum-Ig

20 20 Humorale Immunantwort T-unabhängig T-abhängig

21 21 B-lymphoide Zelle im Peritoneum

22 22 Allelausschluss +/+ -/- Methode: Photoimmunfluoreszenz

23 23 Iso-, Allo- Idiotypic Markers C57Bl/6 (μ b ) Durch Immunisieren z.B. eines Kaninchens mit gereinigtem Maus-IgM aus einer weißen Maus = BALB/c wird die Produktion folgender Kaninchen-Antikörper induziert. Anti-isotypische AK (gegen Epitope in C-Regionen der H- und L-Kette) Anti-idiotypische AK (gegen Epitope in V-Regionen der H- und L-Kette) BALB/c (μ a ) Anti-allotypische AK (gegen ein bestimmtes Epitop In C-Region)

24 24 Initiierung von Prä-B-Zellrezeptorsignalen?? ER Konstitutiv vom ER ER cytoplasm ? Konstitutiv von der Zelloberfläche Ligand cytoplasm ER Liganden induziert cytoplasm ? ?


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