Fluoreszenzpolarisation

Präsentation zum Thema: "Fluoreszenzpolarisation"—  Präsentation transkript:

1 Fluoreszenzpolarisation
Vortrag im Modul biophysikalische Methode Kathrin Helwig und Franziska Schramm

2 Gliederung Einführung Aufbau Grundlagen Vorgehensweise der Messung
Fluorophore Vor- und Nachteile Anwendungsbeispiele Literatur

3 Einführung weitverbreitete Messtechnik in der biophysikalischen Chemie
1926 entwickelt Analyse von molekularen Bindungen

4 Einführung Beobachtung der molekularen Bewegung fluoreszierender Moleküle in Lösung direkte, nahezu momentane Messung Heutige Anwendung für die Wechselwirkungsstudien bspw.DNA-DNA-, DNA-Protein-, Protein-Protein-Bindungen

5 Aufbau

6 Grundlagen

7 Grundlagen

8 Grundlagen

9 Vorgehensweise der Messung
Messung der Polarisation einer Lösung fluoreszenz-markierter Liganden  FP1 Zugabe einer Probelösung mit bestimmter Konzentration in kleinen Voluminas, Inkubation  FP2 ΔFP = FP2- FP1  Änderung des molekularen Volumens

10 Vorgehensweise der Messung
Wiederholung für verschiedene Konzentrationen der Probelösung Graphische Darstellung der Probenkonzentration-ΔFP-Beziehung Temperatur konstant halten Gesamtzeit der Messung: ~ 5 min

11 Fluorophore BODIPY (Borandipyrromethandifluorid) Fluorescein
Rhodamin 6G

12 Vor- und Nachteile homogene Technologie
Reaktionen sind sehr schnell (Sekundenbereich) zur GGW-Einstellung Reagenzien sind stabil große Ansätze können gemacht werden

13 Vor- und Nachteile hohe Reproduzierbarkeit keine Abtrennungsschritte
hoch automatisierte Technik keine Waschschritte  steigert Genauigkeit  schnellere Messung  weniger Abfall Limitiert auf kleine Molekulargewichte

14 Anwendung DNA-DNA-WW Information über DNA-Proben nach Hybridisierung
Oligothyminderivate mit EDA oder HMDA und FITC verwendet

15 Anwendung

16 Anwendungen FPIA: Fluoreszenzpolarisations-Immunoassays
Polarisationsmessungen markierter Antigene Polarisation einer Mischung: aus Polarisation freier und gebundener Antigene und deren relative Fluoreszenzintensität

17 Anwendungen Bsp.: Antigen= Hormon Cortisol, Fluophor = Fluorescein
Mischung aus fluoreszenzmarkierten Cortisol und spezif. Antikörper  Zugabe von reinem Cortisol  Verdrängung des markierten Antigens  Messung der Polarisation  Bestimmung der Cortisolkonzentration, die von den Antikörper gebunden wurden und der Antikörperkonzentration

18 Anwendung Enzyme Activity Imaging

19 Literatur K.Kakehi et al.,Fluorescence polarization: Analysis of Carbohydrate-Protein-Interaction, Analyt.Biochem., 2001, 297, W.J.Checovich et al., Fluorescence poalrization-a new tool for cell and molecular biology, nature, 1995, 375, Xiangning Chen et al.: Fluorescence Polarization in Homogeneous Nucleic Acid Analysis, Genome Res. 1999, 9, Murakami et al., Fluorescent-labeled oligonucleotide probes: detection of hybrid formation in solution by fluorescence polarization spectroscopy, Nucleic Acids Research, 1991, 19 (15), W. Schmidt, Optische Spektroskopie, 2000, 2.Auflage, Wiley-VCH, S. 212 ff

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