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Fluoreszenzpolarisation Vortrag im Modul biophysikalische Methode Kathrin Helwig und Franziska Schramm.

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Präsentation zum Thema: "Fluoreszenzpolarisation Vortrag im Modul biophysikalische Methode Kathrin Helwig und Franziska Schramm."—  Präsentation transkript:

1 Fluoreszenzpolarisation Vortrag im Modul biophysikalische Methode Kathrin Helwig und Franziska Schramm

2 Gliederung Einführung Aufbau Grundlagen Vorgehensweise der Messung Fluorophore Vor- und Nachteile Anwendungsbeispiele Literatur

3 Einführung weitverbreitete Messtechnik in der biophysikalischen Chemie 1926 entwickelt Analyse von molekularen Bindungen

4 Einführung Beobachtung der molekularen Bewegung fluoreszierender Moleküle in Lösung direkte, nahezu momentane Messung Heutige Anwendung für die Wechselwirkungsstudien bspw.DNA-DNA-, DNA-Protein-, Protein-Protein-Bindungen

5 Aufbau

6 Grundlagen

7

8

9 Vorgehensweise der Messung Messung der Polarisation einer Lösung fluoreszenz-markierter Liganden FP1 Zugabe einer Probelösung mit bestimmter Konzentration in kleinen Voluminas, Inkubation FP2 ΔFP = FP2- FP1 Änderung des molekularen Volumens

10 Vorgehensweise der Messung Wiederholung für verschiedene Konzentrationen der Probelösung Graphische Darstellung der Probenkonzentration-ΔFP-Beziehung Temperatur konstant halten Gesamtzeit der Messung: ~ 5 min

11 Fluorophore BODIPY (Borandipyrromethandifluorid) Fluorescein Rhodamin 6G

12 Vor- und Nachteile homogene Technologie Reaktionen sind sehr schnell (Sekundenbereich) zur GGW-Einstellung Reagenzien sind stabil große Ansätze können gemacht werden

13 Vor- und Nachteile hohe Reproduzierbarkeit keine Abtrennungsschritte hoch automatisierte Technik keine Waschschritte steigert Genauigkeit schnellere Messung weniger Abfall Limitiert auf kleine Molekulargewichte

14 Anwendung DNA-DNA-WW Information über DNA-Proben nach Hybridisierung Oligothyminderivate mit EDA oder HMDA und FITC verwendet

15 Anwendung

16 Anwendungen Polarisationsmessungen markierter Antigene Polarisation einer Mischung: aus Polarisation freier und gebundener Antigene und deren relative Fluoreszenzintensität FPIA: Fluoreszenzpolarisations-Immunoassays

17 Anwendungen Bsp.: Antigen= Hormon Cortisol, Fluophor = Fluorescein Mischung aus fluoreszenzmarkierten Cortisol und spezif. Antikörper Zugabe von reinem Cortisol Verdrängung des markierten Antigens Messung der Polarisation Bestimmung der Cortisolkonzentration, die von den Antikörper gebunden wurden und der Antikörperkonzentration

18 Anwendung Enzyme Activity Imaging

19 Literatur K.Kakehi et al.,Fluorescence polarization: Analysis of Carbohydrate- Protein-Interaction, Analyt.Biochem., 2001, 297, W.J.Checovich et al., Fluorescence poalrization-a new tool for cell and molecular biology, nature, 1995, 375, Xiangning Chen et al.: Fluorescence Polarization in Homogeneous Nucleic Acid Analysis, Genome Res. 1999, 9, Murakami et al., Fluorescent-labeled oligonucleotide probes: detection of hybrid formation in solution by fluorescence polarization spectroscopy, Nucleic Acids Research, 1991, 19 (15), W. Schmidt, Optische Spektroskopie, 2000, 2.Auflage, Wiley-VCH, S. 212 ff

20 Ende


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