FT-Infrarot-Spektroskopie

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1 FT-Infrarot-Spektroskopie
Stefan Zorn, Fajun Zhang, Alexander Gerlach Institut für angewandte Physik Tübingen Fourier-Transform-Infrarot-Spektroskopie - Fourier-Transform-Infrarot-Spektroskopie (FT-IR) eignet sich hervorragend zum Nachweis von chemischen Substanzen und der Bestimmung ihrer chemische Umgebung und Konformation - sie spielt eine wichtige Rolle bei der Analyse von Oberflächen und Substanzen Ziele diese Praktikumsversuches: - Verständnis des Messprinzips von FT-IR - Erlernen grundlegender Labortechniken - Umgang und Experimentieren mit biologischen Präparaten - Analyse von Spektren und Auflösungs- verbesserung mit Hilfe mathematischer Methoden und Programme Versuchsaufbau Proteinpuder und Laborwaage zur Herstellung der Proteinlösungen Fourier Transformations Infrarot Spektrometer (FTIR) Vertex70 mit Transmissionseinheit FT-IR Spektrometer als Interferometer Probenhalter für IR Transmissionsmessungen Schematischer Aufbau eines FTIR-Spektrometers Im Versuchsaufbau wird ein FT-IR Spektrometer verwendet, es bietet durch seine Fähigkeit die Frequenz der IR-Strahlung auf den Wegunterschied in einem Michelson Interferometer umzusetzen die Möglichkeit alle Frequenzen auf einmal zu messen und arbeitet somit schneller, genauer und vor allem mit einem höheren Signal-zu-Rausch- Verhältnis als Spektrometer mit dispersiven Elementen IR-Transmissionsspektrum der leeren Zelle bei verschiedenen Abständen der beiden BaF2-Platten Mit Hilfe der Messung der leeren Zelle kann die tatsächliche Dicke des Abstandshalters zwischen den Kristallplatten, der die Dicke der Schicht der Proteinlösung bestimmt, genau vermessen werden. Interferenz an zwei parallelen Platten im Abstand d Physikalische Grundlagen der IR-Spektroskopie Wahrscheinlichkeit der Absorption: Verschiebung der Absorptionsbanden durch Tausch H2O  D2O μ H2O Je höher der Anregungszustand desto stärker Weicht das tatsächliche Potential von der harmonischen Näherung ab D2O Jedes Molekül hat eine bestimmte Anzahl von Normal- Moden – voneinander unabhängige Schwingungen. Man unterscheidet Streck- (Schwingung in Richtung der Bindung) und Deformationsschwingungen. Ändert sich bei der Schwingung das Dipolmoment des Moleküls so ist diese IR-aktiv und kann angeregt werden. Hier sind die Normalmoden von Wasser und Kohlen- dioxid dargestellt. Absorptionsspektren von Wasser (blau), Deuteriumoxid (rot) und einer Mischung beider (grün) Vor allem aufgrund der verschiedenen Masse von Deuterium- bzw. Wasserstoffatomen liegen die Absorptionsbanden von Wasser (blau) und Deuteriumoxid (rot) in verschiedenen Bereichen. Dies macht man sich zunutze um die Absorption von Proteinen in Lösung (Deuteriumoxid) beobachten zu können und auch die Reinheit des Deuteriumoxids festzustellen. Untersuchung der Sekundärstruktur von Proteinen BSA Aufrechterhaltung osmotischer Druck - vorwiegend α -Helix α -Helix Myoglobin - Sauerstofftransport im Muskel - vorwiegend α-Helix Schleife Papain Verdauungsenzym α-Helix β-Faltblatt Schleife β-Faltblatt Amid I Absorptionsbande von Papain Sekundärstrukturanalyse - der planaren Peptidgruppe können 9 Schwingungsmoden zugeordnet werden (Amid A, Amid B und Amid I – VII) - insbesondere in der Amid I Bande (Hauptanteil C-O-Streckschwingung) lassen sich die verschiedenen Sekundärstrukturelemente gut unterscheiden - mit mathematischen Methoden (höhere Ableitungen, Fourier-Selbstdekonvolution,…) ist es möglich die sich überlappenden Absorptionsbanden zu trennen und ihre Positionen zu bestimmen - durch Fitten und Integration von Gaußkurven an diesen Positionen wird der Anteil der einzelnen Strukturmerkmale ermittelt