Lanthanoide als Marker in der Fluoreszenzspektroskopie

Präsentation zum Thema: "Lanthanoide als Marker in der Fluoreszenzspektroskopie"—  Präsentation transkript:

1 Lanthanoide als Marker in der Fluoreszenzspektroskopie
Jan Hoyer Nora Schulze

2 Gliederung 1. Vor- und Nachteile von Lanthanoidenmarkern
2. Allgemeine Vorgehensweise 3. Anwendungen 4. Literatur

3 Anforderungen an Markersubstanzen
gutes Signal/Rausch-Verhältnis kleine Nachweisgrenze einfache Handhabung; Verfügbarkeit der Substanzen möglichst geringe Beeinflussung des zu untersuchenden Systems

4 Vorteile von Ln-Fluoreszenzmarkern
keine Strahlenschäden (vgl. radioaktive Marker) scharfe Banden, geringer Hintergrund  gutes S/N  geringe Nachweisgrenze (bis fmol-Bereich) kurze Messdauer (Sekundenbereich) Nachteil: teurer als herkömmliche Fluoreszenzmarker!

5 Besonderheiten der Fluoreszenz bei Lanthanoiden
Lebensdauer des angeregten Zustandes: ,1 – 1 ms → zeitaufgelöste Unterscheidung von Hintergrundsignal möglich Stokes-Verschiebung über 250 nm geringe Extinktionskoeffizienten → geringes Hintergrundsignal → Sensibilisierung durch „Antennenliganden” notwendig eingesetzte Lanthanoide: Eu, Tb, Sm, Dy

6 Stokes-Verschiebung Abstand zwischen Absorptions- und Emissionsmaximum einer fluoreszierenden Substanz → je größer die Verschiebung, umso weniger Überlappung von Absorptions- und Emissionsspektrum

7 Antennenliganden - Prinzip
Chelatligand bindet Marker und absorbiert eingestrahltes Licht Energie wird auf Lanthanoidion übertragen und als Fluoreszenzsignal emittiert

8 Antennenliganden - Beispiele
hohe KoZ verhindert Bindung von Wasser an Ln, da sonst Desaktivierung

9 Anwendungen DELFIA („dissociation enhanced lanthanide fluoroimmunoassay“) Immunoassays ähnlich ELISA oder RIA Untersuchung von Rezeptor-Ligand-Interaktionen TR-FRET („time resolved fluorescence resonance energy transfer“) → z. B. Untersuchung der Oligomerisierung von Rezeptoren in lebenden Zellen Einführung von Ln-Bindungsstellen in Proteine → unmittelbare Bestimmung von Expressionsleveln → Visualisierung von Proteinen in SDS-PAGE-Gelen

10 DELFIA Beispiel: Bestimmung von Metallothioneinen
→ Expression u. a. als Antwort auf Kontamination mit Schwermetallionen (Komplexierung) zunächst Inkubation mit MT-Antikörper, an diesen bindet sekündärer Antikörper →markiert mit nicht-fluoreszierendem Chelatkomplex (z. B. Eu-DTTA, gebunden über Isothiocyanatgruppe an ε-Aminogruppe von Lys) Erniedrigung des pH führt zu Freisetzung von Ln aus Komplex, Bindung an Antennenliganden → Nachweis

11 Vorteile von DELFIA empfindlicher als ELISA und RIA
kostengünstiger und weniger zeitaufwändig als RIA, keine radioaktive Strahlung Möglichkeit der Automatisierung Verwendung mehrerer Marker gleichzeitig möglich, da unterschiedliche Lebensdauern des angeregten Zustandes und andere Emissionsprofile von Eu, Tb, Sm, Dy → Kosten- und Zeiteinsparung

12 Weitere Möglichkeiten der Verwendung von Lanthanoiden
Lanthaniden-Shift-Reagenzien in NMR Beschleunigung der Proteinstrukturbestimmung mittels RKSA

13 Quellennachweis Life Sciences 77 (2005), 361-371
Analytical Biochemistry 137 (1984), Chembiochem 4 (2003),