KlinFor Workshop B16 ‚Die neuen Tuberkulose Tests‘ QuantiFERON®-Gold In Tube T-SPOT.TB Test Detlev Schultze Dr. med. Dipl Biol. Leitender Arzt Institut für Klinische Mikrobiologie und Immunologie, St. Gallen

Lungen-Tuberkulose versus latente Infektion, CDC 2005 TST oder y-Interferon positiv Röntgen Lunge positiv Husten +/- Blut im Sputum +/- B-Symptomatik Positiv Mikroskopie +/- PCR +/- Kultur aus respiratorischen Proben Latente Infektion TST oder y-Interferon positiv Röntgen Lunge negativ Keine Symptome einer Tuberkulose Proben ohne Erregernachweis

Diagnostik der Lungen Tuberkulose Identifizierung mit PCR und Gensonden Reistenztestung - Ethambutaol - Pyrazinamid - Isoniazid - Rifampicin Adaptiert nach Handbuch Tuberkulose, Lungenliga CH 2007

Diagnostik der latenten Tuberkulose Tuberculosis-Skin-Test (TST ) Interferon-Gamma Release Assay (IGRA) QuantiFERON-Gold In Tube [Cellestis] T-SPOT.TB [Oxford Immunotec])

Vergleich IGRA - TST Interferon-Gamma Release Assay (IGRA) In vitro Spezifische Antigene Keine Boosterung 1 Patienten Visite + Laborkosten Minimale Test-Variabilität Resultate in 2 Tagen Tuberculosis-Skin-Test (TST ) In vivo Weniger spezifische Antigene Boosterung 2 Patienten Visiten höhere Test-Variabilität Resultate in 2 - 3 Tagen

ESAT 6 und CFP10 im Interferon-Gamma Release Assay (IGRA) Mycobacterium-Genom: Region of Difference 1 (RD1) codiert für ESX-1 Sekretionssystem zur Ausschleusung von Early Secretory Antigenic Target (ESAT-6) und Culture Filtrate Protein 10 (CFP-10) aus Mycobacterium-Zelle vorhanden in Mycobacterium tuberculosis → Fähigkeit zur lokalen Ausbreitung und Lyse von Pneumocyten Deletion aus Mycobacterium bovis  Virulenz Minderung fehlt in attenuiertem M.bovis –Stamm = Bacille Calmette-Guérin Rekonstitution in transgenem BCG Stamm → Virulenz Erhöhung Komplex mit CFP-10 und ESAT-6 EMBO Journal 2005 / Champion et al 2007 / Wards et al 2000 / Onyebujoh 2004 TB7.7 is encoded by a phage-inserted region (phiRv2) which is highly specific for M. tuberculosis (6, 8, 12). Aus: Leyten_Discrepancy between Mycobacterium tuberculosis-specific gamma interferon release assays using short and prolonged in vitro incubation_CVI_2007

ESAT 6 und CFP 10 in Mycobacteriaceae Tuberculosis complex Antigene ESAT-6 CFP-10 M tuberculosis + M africanum M bovis BCG substrain   gothenburg - moreau tice tokyo danish glaxo montreal pasteur Environmental strains Antigene ESAT-6 CFP-10 M abcessus - M avium M branderi M celatum M chelonae M fortuitum M gordonii M intracellulare M kansasii + M malmoense M marinum M oenavense M scrofulaceum M smegmatis M szulgai M terrae M vaccae M xenopi

T-SPOT.TB – Blutaufbereitung in Vacutainer CPT™ Röhrli Enzyme-Linked Immunospot (ELISpot) Technologie Röhrli zentrifugieren Lymphocyten Bande aufnehmen Lymphozyten zählen und waschen Lymphozyten in 96-Platte TB Antigene zugeben Übernacht Inkubation

T-SPOT.TB – Spot Bildung Platte waschen Detektionsreagenz zugeben 60 min inkubieren Farbreagenz (Substrat) zugeben Spots innerhalb 7 min Platte waschen und trocknen negativ positiv

T-SPOT.TB – Spot Zählung Mit blossem Auge und Vergrösserungsglas Alternativ mit automatisiertem ELISPOT imager Above: Automated T-SPOT plate reader

QuantiFERON®-Gold In Tube Null TB Mitogen Interferon-y Spiegel vor TB-Stimulation ? T-Zellen durch Phythämagglutinin stimulierbar? T-Zellen durch ESAT-6, CFP-10, TB7.7 stimulierbar ? Konjugat=Obeer AK In den Näpfchen (wells) sind Maus-Antihuman-Gamma-Interferon-AK gebunden, erkennt als o hochspezifisch humanes Gamma-Interferon, ist aber in der Maus hergestellt. Konjugat: Weiterer-Antihuman-Gamma-Interferon-Ak bindet ebenfalls an Gamma-Interferon , An diesen ist eine Meerrettich-Peroxidase , also ein Enzym, gekoppelt, das das zugegebene Subsrtat (Farbstoff) blau färbt. Waschen: Zugabe einer modifizierten PBS (phosophate buffered saline), spült alles was nicht gebunden ist, weg Enzym-Stopplösung( 0,5M Schwefelsäure) wird 30 min nachE inwirkenunter Lichtschuz dzugegeen, es ommt zum ph-Umschlag und Gelbfärbung. Deren OD wird ts 450 nm proportional zur Mengwe des geb Konjugats. Miutogen: PHA: Phytohämagglutintn; muss ESAT-6 negativen positiv reagieren, zeit die grundsätlich fähugkiet dr Zelle an, unspezifisch Gamma-Interferon auszuschütten. Wenn beides negativ indeterminarnt( Ich weiss nicht ob das Immunsystem so gescjhwächt ist), Esat6 pos, Mitogen negativ: weit fortgeschrittenen TB, bei der nur noch ganz zpezifsche Ausschütung möglicb ist.

QuantiFERON®-Gold In Tube 1 Blut Entnahme und Vorbereitung für Test NULL TB Mitogen -Interferon stabil im Kühlschrank (+4°C) 8 Wochen Inkubation 37ºC 16-24 Stunden Zentrifugation 5-15 min 3x1ml Blut Option 1: Versand Blutröhrchen innerhalb 16 Stunden an Labor, vor Inkubation. Option 2: Versand Blutröhrchen innerhalb 3 Tagen an Labor, nach Inkubation Option 3: Sammlung der Proben nach Zentrifugation, ans labor zur -Interferon Messung Konjugat=Obeer AK In den Näpfchen (wells) sind Maus-Antihuman-Gamma-Interferon-AK gebunden, erkennt als o hochspezifisch humanes Gamma-Interferon, ist aber in der Maus hergestellt. Konjugat: Weiterer-Antihuman-Gamma-Interferon-Ak bindet ebenfalls an Gamma-Interferon , An diesen ist eine Meerrettich-Peroxidase , also ein Enzym, gekoppelt, das das zugegebene Subsrtat (Farbstoff) blau färbt. Waschen: Zugabe einer modifizierten PBS (phosophate buffered saline), spült alles was nicht gebunden ist, weg Enzym-Stopplösung( 0,5M Schwefelsäure) wird 30 min nachE inwirkenunter Lichtschuz dzugegeen, es ommt zum ph-Umschlag und Gelbfärbung. Deren OD wird ts 450 nm proportional zur Mengwe des geb Konjugats. Miutogen: PHA: Phytohämagglutintn; muss ESAT-6 negativen positiv reagieren, zeit die grundsätlich fähugkiet dr Zelle an, unspezifisch Gamma-Interferon auszuschütten. Wenn beides negativ indeterminarnt( Ich weiss nicht ob das Immunsystem so gescjhwächt ist), Esat6 pos, Mitogen negativ: weit fortgeschrittenen TB, bei der nur noch ganz zpezifsche Ausschütung möglicb ist.

QuantiFERON®-Gold In Tube 2 γ-Interferon ELISA Inkubation 120 min Raum-Temperatur Stop Lösung und Extinktions-Messung Ergebnis-berechnung [IE/ml] Plasma und Konjugat Waschen und Substrat Zugabe Durchführung 1-2 x pro Woche Positive Ergebnisse → Wiederholung im Doppel → Befund reproduziert Konjugat=Obeer AK In den Näpfchen (wells) sind Maus-Antihuman-Gamma-Interferon-AK gebunden, erkennt als o hochspezifisch humanes Gamma-Interferon, ist aber in der Maus hergestellt. Konjugat: Weiterer-Antihuman-Gamma-Interferon-Ak bindet ebenfalls an Gamma-Interferon , An diesen ist eine Meerrettich-Peroxidase , also ein Enzym, gekoppelt, das das zugegebene Subsrtat (Farbstoff) blau färbt. Waschen: Zugabe einer modifizierten PBS (phosophate buffered saline), spült alles was nicht gebunden ist, weg Enzym-Stopplösung( 0,5M Schwefelsäure) wird 30 min nachE inwirkenunter Lichtschuz dzugegeen, es ommt zum ph-Umschlag und Gelbfärbung. Deren OD wird ts 450 nm proportional zur Mengwe des geb Konjugats. Miutogen: PHA: Phytohämagglutintn; muss ESAT-6 negativen positiv reagieren, zeit die grundsätlich fähugkiet dr Zelle an, unspezifisch Gamma-Interferon auszuschütten. Wenn beides negativ indeterminarnt( Ich weiss nicht ob das Immunsystem so gescjhwächt ist), Esat6 pos, Mitogen negativ: weit fortgeschrittenen TB, bei der nur noch ganz zpezifsche Ausschütung möglicb ist.

QuantiFERON®-Gold In Tube 3 Befundung Konjugat=Obeer AK In den Näpfchen (wells) sind Maus-Antihuman-Gamma-Interferon-AK gebunden, erkennt als o hochspezifisch humanes Gamma-Interferon, ist aber in der Maus hergestellt. Konjugat: Weiterer-Antihuman-Gamma-Interferon-Ak bindet ebenfalls an Gamma-Interferon , An diesen ist eine Meerrettich-Peroxidase , also ein Enzym, gekoppelt, das das zugegebene Subsrtat (Farbstoff) blau färbt. Waschen: Zugabe einer modifizierten PBS (phosophate buffered saline), spült alles was nicht gebunden ist, weg Enzym-Stopplösung( 0,5M Schwefelsäure) wird 30 min nachE inwirkenunter Lichtschuz dzugegeen, es ommt zum ph-Umschlag und Gelbfärbung. Deren OD wird ts 450 nm proportional zur Mengwe des geb Konjugats. Miutogen: PHA: Phytohämagglutintn; muss ESAT-6 negativen positiv reagieren, zeit die grundsätlich fähugkiet dr Zelle an, unspezifisch Gamma-Interferon auszuschütten. Wenn beides negativ indeterminarnt( Ich weiss nicht ob das Immunsystem so gescjhwächt ist), Esat6 pos, Mitogen negativ: weit fortgeschrittenen TB, bei der nur noch ganz zpezifsche Ausschütung möglicb ist.

QuantiFERON®-Gold In Tube - versus - T-SPOT.TB test

QuantiFERON®-Gold In Tube - versus - T-SPOT.TB test

QuantiFERON®-Gold In Tube – Blutentnahme bis Plasmagewinnung Massnahme bei Abweichung Röhrchen-Füllung mit Blut bis Markierung = 1 ml, Test validiert für 0.8-1.2 ml Neues Röhrchen füllen Transport Beachten Lagerungsposition irrelevant vor 37°C Inkubation → erneutes 5 sec- Mischen 37°C Inkubation ? - nein - ja - ja + Zentrifugation 16 Stunden 17 - 27°C 72 Stunden 17 - 27°C 8 Wochen 4°C Inkubation bei 37°C Röhrchenposition aufrecht – Kappe nach oben Erneute Blutentnahme Plasmagewinnung Zentrifugation (5-15 minutes 1‘500–2‘200 g) Sedimenation im Röhrchen abwarten und Plasma vorsichtig ohne Zellen abhebern Gel hat Blutkuchen nicht vom Plasma getrennt → erneute Zentrifugation >2‘200g

QuantiFERON®-Gold In Tube Interpretation – negative Mitogen Kontrolle T-Zellen durch Mitogen (Phythämagglutinin) nicht stimulierbar → IFN--y <0.5 IE/ml Kollektiv mit unterschiedlichem Immunstatus nicht stimulierbar (%) gesunde, immunkompetente Personen 0.3 Patienten mit Autoimmun-Erkrankungen (anti-TNF-a) 5.6 Dialyse Patienten 6.8 Präanalytik nicht beachtet → mangelnde Bildung IFN-y durch … heftiges Schütteln der Röhrchen (5 sec) bis Schaumbildung … geronnenes Blut … ungelöste Antigene Temperatur 17 - 27°C für Lagerung-/Transport Zeitintervall Blutentnahme bis Inkubation … Verfall der T-Zellen Inkubation Röhrchen für 16 - 24 Stunden bei 37°C. … zu kurze Erwärmung Vorrats-Lagerung unbenutzter Röhrchen 4-27°C für 15 Monate … Verfall TB Antigene / Mitogen

Analytische Leistungsfähigkeit von IGRA’s Problem Beurteilung Leistung der IGRA’s im Vergleich mit TST, ohne Gold Standard für die Latente TB Infektion ? TST ist kein Gold Standard, da weder 100% sensitiv noch 100% spezifisch Ohne Gold Standard ist die direkte Ermittlung von Sensitivität und Spezifität der IGRA’s und des TST unmöglich Hypothese Luftübertragung von TB wahrscheinlicher mit längerer Dauer sowie Enge des Kontaktes zu TB Patienten → Exposition korreliert mit IGRA Ergebnis

Analytische Leistungsfähigkeit von IGRA’s Sensitivität in Probanden ohne TB, nach Ausmass Exposition TST = QFN Gold in tube = T-SPOT.TB

Analytische Leistungsfähigkeit von IGRA’s Sensitivität in Probanden mit aktiver TB TST < QFN Gold in tube < T-SPOT.TB

Analytische Leistungsfähigkeit von IGRA’s Spezifität bei sehr geringem Risiko einer TB Infektion TST < QFN Gold in tube = T-SPOT.TB

Analytische Leistungsfähigkeit von IGRA’s Prädiktiver Wert Risiko für Entwicklung aktiver TB bei Patienten mit IGRA Ergebnissen → unbekannt → langfristige Kohortenstudien notwendig