VORLESUNG V DIE UNTERSUCHUNG VON LYMPHOCYTEN I. Lymphocyten lassen sich aus Blut, lymphatischen Organen, Epithelien und aus Entzündungsherden isolieren.

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1 VORLESUNG V DIE UNTERSUCHUNG VON LYMPHOCYTEN I. Lymphocyten lassen sich aus Blut, lymphatischen Organen, Epithelien und aus Entzündungsherden isolieren II. Spezifische Antikörper gegen Zelloberflächen-Moleküle für Aufreinigung und Charakterisierung von Lymphozyten III. Wachstum von Lymphozyten mit polyklonalen Mitogenen oder spezifischen Antigenen IV. Messung von T-Zell-Effektorfunktionen V. Klonierung von homogenen T-Zell-Linien VI. Zusammenfassung

2 METHODEN 1. Reinigung von Lymphocyten mit Hilfe des Dichtegradientzentrifugation METHODEN 1. Reinigung von Lymphocyten mit Hilfe des Dichtegradientzentrifugation

3 Mononukleäre Zellen des peripheren Blutes lassen sich aus Gesamtblut durch Zentrifugation isolieren

4 METHODEN 1. Reinigung von Lymphocyten mit Hilfe des Dichtegradientzentrifugation 2. Identifizierung und Quantifizierung von Lymphocyten aufgrund ihrer Oberflächenantigenen Durchflußcytometrie METHODEN 1. Reinigung von Lymphocyten mit Hilfe des Dichtegradientzentrifugation 2. Identifizierung und Quantifizierung von Lymphocyten aufgrund ihrer Oberflächenantigenen Durchflußcytometrie

5 Durchflußcytometrie ermöglicht die Identifizierung und Quantifizierung von Zellen aufgrund ihrer Oberflächeantigene

6 Die Verteilung von Lymphozytensubpopulationen im peripheren Blut des Menschen

7 Die relative Verteilung lymphozytischer Subpopulationen in verschiedenen Geweben

8 METHODEN 1. Reinigung von Lymphocyten mit Hilfe des Dichtegradientzentrifugation 2. Identifizierung und Quantifizierung von Lymphocyten aufgrund ihrer Oberflächenantigenen Durchflußcytometrie 3. Quantifizierung von antigenspezifischen Lymphocyten Tetramerfärbung METHODEN 1. Reinigung von Lymphocyten mit Hilfe des Dichtegradientzentrifugation 2. Identifizierung und Quantifizierung von Lymphocyten aufgrund ihrer Oberflächenantigenen Durchflußcytometrie 3. Quantifizierung von antigenspezifischen Lymphocyten Tetramerfärbung

9 Schematic representation of a fluorescent MHC class I/peptide tetramer

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11 METHODEN 1. Reinigung von Lymphocyten mit Hilfe des Dichtegradientzentrifugation 2. Identifizierung und Quantifizierung von Lymphocyten aufgrund ihrer Oberflächenantigenen Durchflußcytometrie 3. Quantifizierung von antigenspezifischen Lymphocyten Tetramerfärbung 4. Anreicherung von Lymphocyten I. Fluoreszenzaktivierten Zellsorter (FACS) II. Magnetische Partikel (Beads) gekoppelte Antikörper METHODEN 1. Reinigung von Lymphocyten mit Hilfe des Dichtegradientzentrifugation 2. Identifizierung und Quantifizierung von Lymphocyten aufgrund ihrer Oberflächenantigenen Durchflußcytometrie 3. Quantifizierung von antigenspezifischen Lymphocyten Tetramerfärbung 4. Anreicherung von Lymphocyten I. Fluoreszenzaktivierten Zellsorter (FACS) II. Magnetische Partikel (Beads) gekoppelte Antikörper

12 Subpopulationen von Lymphocyten lassen sich durch an paramagnetische Partikel gekoppelte Antikörper auftrennen

13 METHODEN 1. Reinigung von Lymphocyten mit Hilfe des Dichtegradientzentrifugation 2. Identifizierung und Quantifizierung von Lymphocyten aufgrund ihrer Oberflächenantigenen Durchflußcytometrie 3. Quantifizierung von antigenspezifischen Lymphocyten Tetramerfärbung 4. Anreicherung von Lymphocyten I. Fluoreszenzaktivierten Zellsorter (FACS) II. Magnetische Partikel (Beads) gekoppelte Antikörper 5. Messung von B-Zell-Funktionen I. Antikörperproduktion (ELISA) METHODEN 1. Reinigung von Lymphocyten mit Hilfe des Dichtegradientzentrifugation 2. Identifizierung und Quantifizierung von Lymphocyten aufgrund ihrer Oberflächenantigenen Durchflußcytometrie 3. Quantifizierung von antigenspezifischen Lymphocyten Tetramerfärbung 4. Anreicherung von Lymphocyten I. Fluoreszenzaktivierten Zellsorter (FACS) II. Magnetische Partikel (Beads) gekoppelte Antikörper 5. Messung von B-Zell-Funktionen I. Antikörperproduktion (ELISA)

14 Messung der Antikörperproduktion mit Hilfe eines ELISA

15 METHODEN 1. Reinigung von Lymphocyten mit Hilfe des Dichtegradientzentrifugation 2. Identifizierung und Quantifizierung von Lymphocyten aufgrund ihrer Oberflächenantigenen (Durchflußcytometrie) 3. Quantifizierung von antigenspezifischen Lymphocyten (Tetramerfärbung) 4. Anreicherung von Lymphocyten I. Fluoreszenzaktivierten Zellsorter (FACS) II. Magnetische Partikel (Beads) gekoppelte Antikörper 5. Messung von B-Zell-Funktionen I. Antikörperproduktion (ELISA) 6. Messung von T-Zell-Funktionen I. Antigenspezifische Proliferation METHODEN 1. Reinigung von Lymphocyten mit Hilfe des Dichtegradientzentrifugation 2. Identifizierung und Quantifizierung von Lymphocyten aufgrund ihrer Oberflächenantigenen (Durchflußcytometrie) 3. Quantifizierung von antigenspezifischen Lymphocyten (Tetramerfärbung) 4. Anreicherung von Lymphocyten I. Fluoreszenzaktivierten Zellsorter (FACS) II. Magnetische Partikel (Beads) gekoppelte Antikörper 5. Messung von B-Zell-Funktionen I. Antikörperproduktion (ELISA) 6. Messung von T-Zell-Funktionen I. Antigenspezifische Proliferation

16 Die antigenspezifische T-Zell-Proliferation als Test für T-Zell-Antworten

17 METHODEN 1. Reinigung von Lymphocyten mit Hilfe des Dichtegradientzentrifugation 2. Identifizierung und Quantifizierung von Lymphocyten aufgrund ihrer Oberflächenantigenen (Durchflußcytometrie) 3. Quantifizierung von antigenspezifischen Lymphocyten (Tetramerfärbung) 4. Anreicherung von Lymphocyten I. Fluoreszenzaktivierten Zellsorter (FACS) II. Magnetische Partikel (Beads) gekoppelte Antikörper 5. Messung von B-Zell-Funktionen I. Antikörperproduktion (ELISA) 6. Messung von T-Zell-Funktionen I. Antigenspezifische Proliferation II. Produktion von Cytokinen A. ELISA B. ELISPOT METHODEN 1. Reinigung von Lymphocyten mit Hilfe des Dichtegradientzentrifugation 2. Identifizierung und Quantifizierung von Lymphocyten aufgrund ihrer Oberflächenantigenen (Durchflußcytometrie) 3. Quantifizierung von antigenspezifischen Lymphocyten (Tetramerfärbung) 4. Anreicherung von Lymphocyten I. Fluoreszenzaktivierten Zellsorter (FACS) II. Magnetische Partikel (Beads) gekoppelte Antikörper 5. Messung von B-Zell-Funktionen I. Antikörperproduktion (ELISA) 6. Messung von T-Zell-Funktionen I. Antigenspezifische Proliferation II. Produktion von Cytokinen A. ELISA B. ELISPOT

18 Cytokine produktion by CD4 + and CD8 + cells

19 Messung der Produktion von IL-2 mit Hilfe eines ELISA

20 Messung der Produktion Cytokinen mit Hilfe eines ELISPOT

21 METHODEN 1. Reinigung von Lymphocyten mit Hilfe des Dichtegradientzentrifugation 2. Identifizierung und Quantifizierung von Lymphocyten aufgrund ihrer Oberflächenantigenen (Durchflußcytometrie) 3. Quantifizierung von antigenspezifischen Lymphocyten (Tetramerfärbung) 4. Anreicherung von Lymphocyten I. Fluoreszenzaktivierten Zellsorter (FACS) II. Magnetische Partikel (Beads) gekoppelte Antikörper 5. Messung von B-Zell-Funktionen I. Antikörperproduktion (ELISA) 6. Messung von T-Zell-Funktionen I. Antigenspezifische Proliferation II. Produktion von Cytokinen A. ELISA B. ELISPOT III. Abtöten von Zielzellen A. Chromfreisetzung aus markierten Zielzellen B. Markierung von Zielzellen mit Fluoreszenz (CFSE) METHODEN 1. Reinigung von Lymphocyten mit Hilfe des Dichtegradientzentrifugation 2. Identifizierung und Quantifizierung von Lymphocyten aufgrund ihrer Oberflächenantigenen (Durchflußcytometrie) 3. Quantifizierung von antigenspezifischen Lymphocyten (Tetramerfärbung) 4. Anreicherung von Lymphocyten I. Fluoreszenzaktivierten Zellsorter (FACS) II. Magnetische Partikel (Beads) gekoppelte Antikörper 5. Messung von B-Zell-Funktionen I. Antikörperproduktion (ELISA) 6. Messung von T-Zell-Funktionen I. Antigenspezifische Proliferation II. Produktion von Cytokinen A. ELISA B. ELISPOT III. Abtöten von Zielzellen A. Chromfreisetzung aus markierten Zielzellen B. Markierung von Zielzellen mit Fluoreszenz (CFSE)

22 Messung der Aktivität cytotoxischer T-Zellen anhand der Chromfreisetzung aus markierten Zielzellen

23 METHODEN 1. Reinigung von Lymphocyten mit Hilfe des Dichtegradientzentrifugation 2. Identifizierung und Quantifizierung von Lymphocyten aufgrund ihrer Oberflächenantigenen (Durchflußcytometrie) 3. Quantifizierung von antigenspezifischen Lymphocyten (Tetramerfärbung) 4. Anreicherung von Lymphocyten I. Fluoreszenzaktivierten Zellsorter (FACS) II. Magnetische Partikel (Beads) gekoppelte Antikörper 5. Messung von B-Zell-Funktionen I. Antikörperproduktion (ELISA) 6. Messung von T-Zell-Funktionen I. Antigenspezifische Proliferation II. Produktion von Cytokinen A. ELISA B. ELISPOT III. Abtöten von Zielzellen A. Chromfreisetzung aus markierten Zielzellen B. Markierung von Zielzellen mit Fluoreszenz (CFSE) 7. Generierung antigenspezifischer T-Zellen METHODEN 1. Reinigung von Lymphocyten mit Hilfe des Dichtegradientzentrifugation 2. Identifizierung und Quantifizierung von Lymphocyten aufgrund ihrer Oberflächenantigenen (Durchflußcytometrie) 3. Quantifizierung von antigenspezifischen Lymphocyten (Tetramerfärbung) 4. Anreicherung von Lymphocyten I. Fluoreszenzaktivierten Zellsorter (FACS) II. Magnetische Partikel (Beads) gekoppelte Antikörper 5. Messung von B-Zell-Funktionen I. Antikörperproduktion (ELISA) 6. Messung von T-Zell-Funktionen I. Antigenspezifische Proliferation II. Produktion von Cytokinen A. ELISA B. ELISPOT III. Abtöten von Zielzellen A. Chromfreisetzung aus markierten Zielzellen B. Markierung von Zielzellen mit Fluoreszenz (CFSE) 7. Generierung antigenspezifischer T-Zellen

24 Klonierung von T-Zell-Linien

25 ZUSAMMENFASSUNG 1. Die zelluläre Basis der adaptiven Immunität ist die klonale Selektion Lymphocyten durch Antigene. Daher ist die Isolierung der Lymphocyten erforderlich 2. Lymphocyten lassen sich durch Antikörper, die Moleküle an der Zelloberfläche erkennen, in Subpopulationen unterteilen 3. Physikalische Auftrennung der Lymphocyten mit Hilfe magnetischer Partikel oder mittels einer fluoreszenzaktivierten Zellseparation gestattet eine quantitative Analyse der Zellverteilung 4. Die Zellfunktionen der isolierten Populationen lassen sich in vitro und in vivo untersuchen ZUSAMMENFASSUNG 1. Die zelluläre Basis der adaptiven Immunität ist die klonale Selektion Lymphocyten durch Antigene. Daher ist die Isolierung der Lymphocyten erforderlich 2. Lymphocyten lassen sich durch Antikörper, die Moleküle an der Zelloberfläche erkennen, in Subpopulationen unterteilen 3. Physikalische Auftrennung der Lymphocyten mit Hilfe magnetischer Partikel oder mittels einer fluoreszenzaktivierten Zellseparation gestattet eine quantitative Analyse der Zellverteilung 4. Die Zellfunktionen der isolierten Populationen lassen sich in vitro und in vivo untersuchen