”Vaccines” Regulation of acquired immune responses

Präsentation zum Thema: "”Vaccines” Regulation of acquired immune responses"—  Präsentation transkript:

1 ”Vaccines” Regulation of acquired immune responses
during infection with intracelllular bacteria ”Vaccines”

2 Geschichte der Vakzinierung: eine Erfolgsgeschichte !
Vor und nach Einführung des Impfstoffes (CDC seit 1912) Polio % (USA, Westeuropa) Pocken % (weltweit) Masern/Mumps/Röteln % (USA) Diphtherie % (USA, Westeuropa) Keuchhusten % (USA) Vor und nach Einführung des Impfstoffes (UK seit 1999) Neisseria meningitidis C % (Kleinkinder) 95 % (Heranwachsende) Salmonella Vi Konjugat % (2 - 4 jährige Kinder) Sicherheit ? Masern-Enzephalopathie /1000 natürliche Infektion 1/ Impfung

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4 Die drei größten Killer
in Millionen (Jahr 2000) 2.3 AIDS 1,7 TB 0.5 TB/HIV 1.2 Malaria

5 Dringend benötigte Impfstoffe:
HIV Tuberkulose Malaria Hepatitis C Chlamydien Helicobacter pylori Leishmaniose Filariose Schistosomiasis (Bilharziose) Papilloma Virus Rotaviren (Durchfallerkrankungen) Respiratorisches Synzytienvirus (RSV), Rhinoviren u.v.a. Nicht nur Infektionskrankheiten Tumorvakzine Alzheimer

6 Neue Ansätze zur Impfstoff-Entwicklung
► Memory/Immuologisches Gedächtnis ► Wirksamkeit von Vakzinen Nachweis von Immunantworten ► Neue Strategien zur Verbesserung alter und zur Entwicklung neuer Vakzine !

7 Memory/Immunologisches Gedächtnis
► B-Zell-Memory - Antikörper - Memory-B-Zellen - Plasmazellen ► T-Zell-Memory - CD4 Th-Zellen - CD8 T-Zellen

8 B-Zellen/Antikörper ► mit wenigen Ausnahmen beruhen alle
zur Zeit verwendeten Impfstoffe auf der Induktion von B-Zellen/Antikörpern ► Antikörper sind relativ leicht induzierbar ► Die Induktion und Wirksamkeit von Antikörpern lässt sich relativ einfach testen. -> Nachweis der Wirksamkeit der Vakzine

9 B-Zell-Memory/Antikörper:
Nachweis einer B-Lymphozytenantwort ► Qualitativer und quantitativer Nachweis von spezifischen Antikörpern • ELISA (enzyme-linked immunosorbant assay) • Western-Blot • Neutralisierungstests ► Nachweis der antikörperbildenden Zellen • Plaquetest • ELISPOT-Assay (enzyme-linked immunospot assay)

10 Memory-T-Zellen Verschiedene Memory-T-Zellsubpopulationen ► CD4, CD8
► CD4 Th-Zellsubpopulationen (Zytokin-Profil) - Th1, Th2, Th17…. ► Memory-T-Zellsubpopulationen - central Memory T-Zellen - effector Memory T-Zellen ► Expression von (hemmenden) Co-Rezeptoren ► Lokalisation der T-Zellen - Lunge, Darm…. Welche dieser Populationen schützt ??

11 Central vs Effector-Memory T-Zellen
CD4 CD4 CD8 Sallusto et al, Science 1999

12 Central vs Effector-Memory T-Zellen
Central Effector CCR CD62L /- Gewebe Lymphgewebe Peripherie Proliferation /- Effektorfunktion +/ Cosignale ? - Lebensdauer + ?

13 Methoden zur Analyse der erworbenen T-Zellantwort
Problem: Kein Antigen-spezifisches, den Antikörpern vergleichbares und einfach messbares Zellprodukt vorhanden!

14 Qualitative Nachweismethoden für T-Zellen
(z.T. semi-quantitativ) in vitro • Proliferation und Zytokinproduktion nach Stimulation mit dem Antigen • Zytotoxizität • Limitierende Verdünnungskultur (Limiting Dilution Assay) • T-Zellklonierung und Analyse der individuellen Klone in vivo • DTH Reaktion (Tuberkulin-Test) • Bestimmung der schützenden Immunität “Infektionsexperimente“

15 Neuere Methoden zur quantitativen und qualitativen
Analyse der T-Lymphozyten-Antwort • ELISPOT-Assay • Intrazelluläre Zytokinfärbung nach kurzer Antigenstimulation • MHC/Peptid-Komplexe (Tetramere)

16 Klassisches Beispiel einer Delayed-Type-Hypersensitivity-Reaction: Tuberkulin-Test
Fig Janeway

17 Zytokintest

18 Tag nach einer Infektion mit
Bestimmung der schützenden Immunität (Infektionsexperimente) 100 naiv 80 immunisiert mit einem attenuierten S. typhimurium-Stamm 60 40 20 20 40 60 80 Tag nach einer Infektion mit S. typhimurium (400 i.v.)

19 Bestimmung der schützenden Immunität (Infektionsexperimente)
-> Große Impfstudien können auch als Infektionsexperiment angesehen werden

20 ELISPOT-Assay (enzyme-linked immunospot assay) Methode:
APC * T APC * anti-IFNg-Antikörper + T-Zellen + APC +Antigen 24h E E E E E Entfernen der Zellen Substrat anti-IFNg-Antikörper -Enzymkomplex

21 ELISPOT-Assay Beispiel - - ohne Antigen IFN-g+ Spots/105 Zellen mit
250 ohne Antigen 200 150 IFN-g+ Spots/105 Zellen 100 50 mit Antigen - Antigen - Antigen naiv infiziert

22 FACS: Intrazelluläre Zytokinfärbung
Prinzip: Blockade der Zytokinsekretion (Brefeldin A) Fixierung und Permeabilisierung der Zellen intrazelluläre Zytokinfärbung mit Antikörpern

23 Intrazelluläre Zytokinfärbung Beispiel:
Inkubation FACS CD8 T T T T APZ APZ APZ APZ extra- und intrazelluläre Färbung IFN - g IFN - g CD8 T T T T APZ APZ APZ APZ 4h

24 Multizytokin-Produzenten

25 MHC Klasse I-Tetramere Prinzip
H-2Kd Peptid (LLO91-99) PE Streptavidin b2-Mikroglobulin Biotin PE Streptavidin CD8 TZR

26 L. monocytogenes-Infektionsmodell
Primärinfektion (103 i.v.) Titer Sekundärinfektion (105 i.v.) 1 2 Wochen

27 L. monocytogenes-Infektionsmodell
Primärinfektion Tag 0 Tag 4 Tag 7 Tag 10 Tag 17 0,02 0,14 2,22 3,11 1,41 Sekundärinfektion Tetramer PE 0,36 1,48 20,05 9,44 Tag 0 Tag 3 Tag 5 Tag 7 CD62L FITC Epitop: Listeriolysin O Peptid 91-99

28 HIV-Infektion anti-viral Therapy 3 107 106 2 105
HLA-B27-gag staining (%) Viral load (copies per ml) 104 1 103 102 100 200 300 400 Days after HIV infection McMichael and Rowland-Jones, Nature :908

29 Akute Infektiöse Mononukleose (Epstein-Barr-Virus)
Callan et al. JEM :1395

30 Grundlagenforschung und Vakzine-Entwicklung:
Biologie der Immunantwort: Welche Immunantwort schützt? (Welche führt zu Pathologie?) Tiermodelle zur Testung Korrelat für Schutz im Menschen. Biologie des Erregers: Lokalisation im Wirt, in der Wirtszelle? Virulenzfaktoren, Attenuierung (Abschwächung) Impfstoff-Kandidatenauswahl. - Genome, Proteome. - Welche Antigene macht der Erreger im Wirt?

31 “Correlates of protection“
Hauptproblem: Wie sieht eine schützende Immunantwort überhaupt aus? “Correlates of protection“

32 Correlates of protection
Für wichtige Krankheitserreger ist unklar wie eine schützende Immunantwort aussieht! ► B-Zellen und/oder T-Zellen? ► Zielstrukturen/Antigene für T- und B-Zellen? ► Quantität der Memory-T-Zellen? ► Qualität der Memory-T-Zellen? - Zytokinprofil (multi-Zytokinproduzenten) - Oberflächenmoleküle - Langlebigkeit - Effektorfunktionen/Proliferation

33 Neue Strategien: 1. Subunit-Vakzine: - rekombinante Proteine
- Peptide, Peptide-Agglomerate 2. Lebend attenuiert: gezielte Eliminierung von Virulenzfaktoren 3. Lebend rekombinant: - Antigene (Eigen-, Fremd-) - Zytokine (IL-12, GM-CSF) - Zytolysine (Listeriolysin) 4. DNA: Antigene, Zytokine, CpG-Motive 5. Neue Adjuvantien 6. Prime-Boost-Ansätze

34 + - Subunit-Vakzine rekombinante
rekombinante Proteine sicher, definiert, stabil wenig immunogen richtige Konformation keine CD8 T-Zellen (B-Zellen) -> Lipoproteine, Adjuvantien, Polysaccharidkonjugate Peptide sicher, definiert, stabil wenig immunogen billig keine CD8 T-Zellen Konformation (B-Zellen) MHC (Impflöcher) -> Lipopeptide, Adjuvantien, Polysaccharidkonjugate, Choleratoxoid-Konjugate, Polypeptide mit Schnittstellen für Proteasomen

35 + - Attenuierte (rekombinante) Lebend-Vakzine
Lebend/ ähnlich der Infektion, Entzündung attenuiert immunogen, Gedächtnis, Sicherheit mukosale Immunität, Immunsuppression Persistenz, Reversion multivalent Rekombination immunstimulatorisch lange Erfahrung (Vaccinia, Adenoviren, BCG, Salmonellen) -> Expression rekombinanter Fremdantigene, Zytokine; Prime/Boost Vakzinierung

36 - + Nackte DNA Vakzine Nackte Persistenz, ähnlich Sicherheit ?
DNA der Infektion, Einbau billig, haltbar CD4, CD8 T-Zellen, B-Zellen Zytokingene CpGs: hohe konzentrationen nicht-methylierter Motive Aktivierung von TLR-9 -> TH1 -Antwort

37 + - Adjuvantien Adjuvantien Depoteffekt Entzündung
alle Prozessierungswege Immunstimulation Aluminiumhydroxid, Aluminiumphosphat ISCOMs, Saponin, Mannosepolymere Öl in Wasser, Liposomen Virus-like Particles Lipid A Cholera-Toxoid (B-Untereinheit)

38 Prime-Boost-Vakzinierung
McShane et al. Nat. Med :1240

39 Prime-Boost-Vakzinierung
TB reactive T-Zellen

40 Ist eine Impfung möglich?
Tuberkulose Ist eine Impfung möglich?

41 Tuberkuloseerreger leben in Wirtsmakrophagen
Mykobakterien T-Zellen schützen gegen Tuberkulose-Erreger

42 # wahrscheinlich der am häufigsten verwendete Impfstoff
1927: Der Impfstoff M. bovis Bacille-Calmette-Guerin (BCG) attenuierte M. bovis-Stamm Léon Charles Albert Calmette ( ) Jean-Marie Camille Guérin ( ) # wahrscheinlich der am häufigsten verwendete Impfstoff # zunehmender Wirkungsverlust!!

43 Listerien entweichen ins Zytoplasma der Zelle:
Listeriolysin Listeria monocytogenes O min 20 min

44 Schutz durch einen gentechnisch veränderten Impfstamm: rBCGureC-Hly
Aerosol Infektion mit dem Beijing Stamm in der Maus. ungeimpft BCG BCG ureC Hly Grode et al. JCI 2005

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46 Verschiedene Vakzinierungsstrategien gegen SIV gag
in Rhesusaffen

47 CD4 Zellen viral load

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51 McElrath et al. Lancet 2008

52 Die Bill-und-Melinda-Gates-Stiftung gibt
ihnen mehrere Millionen Euro zur Impfstoffentwicklung. Wie gehen sie vor?