Erstellen von stabilen in vitro Zell-Expressionssystemen

Präsentation zum Thema: "Erstellen von stabilen in vitro Zell-Expressionssystemen"—  Präsentation transkript:

1 Erstellen von stabilen in vitro Zell-Expressionssystemen
Zellen bilden gewünschtes Protein (z.B. ein Transporterprotein) Selektion und Isolation der erfolgreich transfizierten Zellen Transfektion oder Infektion der Zielzelle mit dem Gen of interest (GI) GI GI GI Zielzellen in Kulturschale

2 in-vitro Testung der Influx-Transporterfunktion von stabil transfizierten Zellen gegenüber nicht transfizierten Zellen Lyse der Zellen Konzentrationsbestimmung des Substrates mittels LC-MS/MS oder Elisa bei nicht radioaktiv markierten Substraten oder β-counter bei radioaktiv markierten Proben. Nach Gesamtproteinbestimmung Vergleich zwischen stabil transfizierten und nicht transfizierten Zellen. Abwaschen des nicht aufgenommenen Substrates transfizierte Zellen nehmen Substrat auf, wenn Substrat transporterspezifisch ist, Kontrollzellen nicht oder deutlich weniger, da der Transporter fehlt oder nur gering exprimiert wird Zugabe von Substrat Stabil transfizierte Zellen Nicht transfizierte Kontrollzellen

3 in-vitro Testung der Transporterinhibition von endogen exprimierenden oder stabil transfizierten Zellen Abwaschen des überschüssigen Substrates Lyse der Zellen Konzentrationsbestimmung des Substrates mittels LC-MS/MS oder Elisa bei nicht radioaktiv markierten Substraten oder β-counter bei radioaktiv markierten Proben. Nach Gesamtproteinbestimmung Vergleich zwischen inhibierten Zellen und Kontrollzellen. Kontrollzellen nehmen Substrat auf, wenn Substrat transporterspezifisch ist. Die inhibierten Zellen nehmen weniger oder kein Substrat auf, da der Transporter blockiert ist Abwaschen des überschüssigen Inhibitors Inhibitor zu den den zu untersuchenden Transporter exprimierenden Zellen geben, Kontrollzellen ohne Inhibitor Inhibitor lagert sich an Transporter an Zugabe von Substrat Kontrollzellen

4 in-vitro Testung der Efflux-Transporterfunktion von stabil transfizierten Zellen gegenüber nicht transfizierten Zellen Zellen lysieren ggfs. apikale und balolaterale Membranen trennen Substrat gelangt über Efflux-Transporter in das Innere der Vesikel über Membranen der transfizierten Zellen, wenn Substrat transporterspezifisch ist, die Vesikel der Membranen der Kontrollzellen nehmen kein Substrat oder nur wenig auf, da der Transporter fehlt oder nur gering exprimiert wird Membranen isolieren Zugabe von Substrat Membranen bilden inside-out-Vesikel, d.h. die inneren Membranbestandteile liegen außen und umgekehrt Konzentrationsbestimmung des Substrates mittels LC-MS/MS oder Elisa bei nicht radioaktiv markierten Substraten oder β-counter bei radioaktiv markierten Proben. Nach Gesamtproteinbestimmung Vergleich zwischen stabil transfizierten und nicht transfizierten Zellen. Homogenisieren der Vesikel Abwaschendes nicht aufgenommenen Substrates Stabil transfizierte Zellen Nicht transfizierte Kontrollzellen