Interaktion zwischen Metronidazol und parodontopathogenen Bakterien im Zusammenhang mit KB-Zellen Daniela Stephan.

Präsentation zum Thema: "Interaktion zwischen Metronidazol und parodontopathogenen Bakterien im Zusammenhang mit KB-Zellen Daniela Stephan."—  Präsentation transkript:

1 Interaktion zwischen Metronidazol und parodontopathogenen Bakterien im Zusammenhang mit KB-Zellen Daniela Stephan

2 Einleitung  „Die Parodontitis ist die häufigste chronisch-entzündliche Erkrankung des Menschen“ (Henderson et al. 2003).  Actinobacillus actinomycetemcomitans ist der Leitkeim der aggressiven lokalisierten Parodontitis (Slots und Ting 1999).  Porphyromonas gingivalis verursacht vor allem schwere Formen der chronische Parodontitis (Slots und Ting 1999).

3 Metronidazol  Gruppe der Nitroimidazolderivate  Anaerobes Wirkungsspektrum  Antibakterielle Wirkung in reduzierter Form auf Nukleinsäuresynthese der Mikroorganismen  In der Parodontitistherapie: Lokale Applikation als Elyzol-Gel, Systemische Anwendung oft in Kombination mit Amoxicillin N N CH 3 O3NO3N CH 2 CH 2 OHEinleitung

4 Zytokine  Definition: Lösliche, niedrigmolekulare Proteine, die von verschiedenen Zelltypen des Wirtsorganismus sezerniert werden und der Regulation von Zellfunktionen dienen  Einteilung: Interleukine, Chemokine, Interferone, Wachstumsfaktoren, Tumornekrosefaktoren, koloniestimulierende Faktoren  In der Pathogenese der Parodontitis von Bedeutung: IL-1,IL-6, IL-8, IL-10, TGF-β1, TNF-α  Zytokine sind sowohl an der Regulation der angeborenen als auch der erworbenen Immunabwehr beteiligt (Sandros et. al. 2000)Einleitung

5 Ziele der Arbeit  Untersuchung der Wirkung verschiedener Metronidazolkonzentrationen auf die parodontopathogenen Bakterien Porphyromonas gingivalis ATCC 33277 und Actinobacillus actinomycetemcomitans Y4 im Zusammenhang mit KB-Zellen  Bestimmung von Wirkungsunterschieden des Metronidazols auf freie, adhärente und invasive Bakterien  Ermittlung des Einflusses von parodontopathogenen Bakterien sowie von Metronidazol auf die Freisetzung von Zytokinen aus KB-Zellen

6 Material und Methoden  Ermittlung der minimalen Hemmkonzentration (MHK) von Metronidazols gegenüber den Bakterienstämmen A. actinomycetemcomitans Y4: > 256 µg/ml P. gingivalis ATCC 33277: 0,125 µg/ml

7 Material und Methoden  In-vitro-Studie an KB-Zellen, einer permanenten Epithelzellreihe  Durchführung von drei Versuchsreihen: Vorinkubation der Zellen mit Metronidazol Vorinkubation der Bakterien mit Metronidazol Zugabe des Metronidazols zum Zeitpunkt der Infektion der Zellen

8 Verwendung folgender Metronidazolkonzentrationen: ohne Metronidazol (Kontrolle) 1/4 MHK 10 µg/ml Metronidazol 100 µg/ml Metronidazol 24-Well-Platte ohne Bakterien Infektion mit Bakterienstamm

9 Metronidazol Material und Methoden P. gingivalis ATCC 33277 bzw. A. actinomycetemcomitans Y4 Monolayer von KB-Zellen Inkubation 1, 6 und 18 h Zelllyse Gewinnen der Überstände Zahl adhärenter Zahl frei vorkommender Bakterien (KBE) Bakterien (KBE) Zugabe von Antibiotikum Freigesetzte Zytokine zum Abtöten adhärenter Bakterien IL-1β, IL-6, IL- 8, TNFα und TGF- β1 Zelllyse Zahl intrazellulärer Bakterien (KBE)

10 A. actinomycetemcomitans Y4 Zugabe des Metronidazols bei Infektion der Zellen 1 10 100 1.000 10.000 100.000 1.000.000 10.000.000 Anzahl der Bakterien (KBE/Well) 1 h6 h18 h6 h18 h1 h6 h18 h AdhärenzInvasionfreie Bakterien Bei allen Versuchen mit A. actinomycetemcomitans Y4 konnte keine Reduktion der Kolonie bildenden Einheiten detektiert werden. ohne Metronidazol (Kontrolle)2,5 µg/ml Metronidazol 10 µg/ml Metronidazol100 µg/mlMetronidazol Ergebnisse – Antibakterielle Effekte

11 P. gingivalis ATCC 33277 Zugabe des Metronidazols bei Infektion der Zellen ohne Metronidazol (Kontrolle)2,5 µg/ml Metronidazol 10 µg/ml Metronidazol100 µg/mlMetronidazol Ergebnisse – Antibakterielle Effekte Bei den Versuchen mit P. gingivalis ATCC 33277 konnte nur eine geringe Verminderung der Bakterienzahlen ermittelt werden.

12 Freisetzung von TGF-β 1 aus KB-Zellen Ergebnisse - Zytokinfreisetzung Die Konzentrationen von TGF-β1 waren kurzzeitig nach Zugabe des Metronidazols leicht erhöht. Ein eindeutiges Ergebnis konnte nicht erzielt werden. 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 MAaPgMAaPgMAaPg Konzentration (pg/ml) 1 h 6 h18 h ohne Metronidazol 10 µg/ml Metronidazol 1/4 MHK 100 µg/ml Metronidazol Zugabe des Metronidazols bei Infektion der Zellen

13 Freisetzung von IL-8 aus KB-Zellen 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 MAaPgMAaPgMAaPg Konzentration (pg/ml) Zugabe des Metronidazols bei Infektion der Zellen ohne Metronidazol 10 µg/ml Metronidazol 1/4 MHK 100 µg/ml Metronidazol Metronidazol induziert die Freisetzung von IL-8 aus KB-Zellen. Bei Infektion der Zellen mit A. actinomycetemcomitans konnten ebenfalls erhöhte Konzentrationen von IL-8 nachgewiesen werden. 1 h 6 h18 h Ergebnisse - Zytokinfreisetzung

14 Ursachen der Ineffektivität von Metronidazol gegenüber A. actinomycetemcomitans Y4  Mikroaerophiles Bakterium – Ergebnisse in guter Übereinstimmung mit dem festgestellten anaeroben Wirkungsspektrum von Metronidazol (Chow et al. 1977)  In vielen In-vitro-Studien Resistenz von A. actinomycetemcomitans gegenüber Metronidazol festgestellt (Eick et al. 2004, Müller et al. 2002) Antibakterielle Effekte Diskussion - Antibakterielle Effekte

15 Mögliche Ursachen der Ineffektivität von Metronidazol gegenüber P. gingivalis ATCC 33277  Biofilmbildung der adhärenten Bakterien an den KB-Zellen mit nachfolgender schlechteren Wirksamkeit des Metronidazols (Eick et al. 2004)?  Veränderung des Phänotyps von invasiven Bakterien (Eick und Pfister 2004)?  Interaktion zwischen Zellen und Bakterien oder zwischen den Zellen und dem Metronidazol führt zu Hemmung oder Inaktivierung der Nitroreduktasen der Bakterien und somit entsteht keine antibakteriell wirksame Form des Metronidazols? Antibakterielle Effekte Diskussion - Antibakterielle Effekte

16 Einfluss von Metronidazol und den Bakterien auf die Freisetzung von TGF-β 1 aus KB-Zellen  TGF-β 1 hemmt die Produktion von Matrix-Metalloproteinasen, die zum Abbau der interzellulären Matrix führen. Die Erhöhung der TGF-β1-Konzentration im parodontalen Gewebe könnte die Regeneration des entzündeten Gewebes unterstützen (Chang et al. 2002)  Die kurzfristige Induktion der TGF-β 1 -Bildung durch Metronidazol könnte einen positiven Einfluss auf den Entzündungsprozess haben. Diskussion - Zytokinfreisetzung

17 Einfluss von Metronidazol und den Bakterien auf die Freisetzung von Interleukin-8 aus KB-Zellen  P. gingivalis induziert in KB-Zellen die Produktion von IL-8, seine Proteasen bauen IL-8 ab (Zhang et al. 1999)  Metronidazol hat keinen Einfluss auf den Abbau von IL-8 durch Proteasen von P. gingivalis  Metronidazol und P. gingivalis – doppelte Induzierung der IL-8- Freisetzung aus KB-Zellen?  IL-8 beeinflusst im Rahmen der angeborenen Immunantwort die Anlockung von polymorphkernigen Granulozyten. Diskussion - Zytokinfreisetzung

18 Schlussfolgerungen  Die antibakterielle Wirkung des Metronidazols auf Actinobacillus actinomycetemcomitans und Porphyromonas gingivalis im Kontakt zu KB-Zellen ist gering. Metronidazol kann in der Therapie parodontaler Erkrankungen nur adjunktiv angewendet werden.  Metronidazol hat immunmodulatorische Eigenschaften. Im Zusammenhang mit Deep Scaling und Root planing könnte dies positiv zu bewerten sein, da es die initiale Immunantwort stimuliert.