siRNA-vermittelte Hemmung antiapoptotischer Gene in Harnblasenkarzinomzelllinien Doreen Kunze 1, Kai Krämer 1, Susanne Füssel 1, Oliver W. Hakenberg 2, Manfred P. Wirth 1, Marc-Oliver Grimm 1 1 Klinik und Poliklinik für Urologie, Technische Universität Dresden, Deutschland, 2 Urologische Klinik und Poliklinik, Universitätsklinikum Rostock, Deutschland Ziel Methode Pro Zielgen wurden zwei siRNAs (D1&D2) ausgewählt. Diese wurden einzeln (10 nM siRNA) bzw. in Kombinationen von 4 (je 10 nM einer siRNA pro Target) oder 8 siRNAs (je 5 nM pro siRNA) lipidvermittelt in EJ28-BCa-Zellen transfiziert. Als Kontrolle und zur Normierung diente, eine „non-silencing siRNA“ (ns-siRNA) ohne Homologie zu humanen mRNAs (10 bzw. 40 nM). 48 und 72 Stunden nach Transfektion Bestimmung von: mRNA-Expressionsniveaus der Targets: quantitative PCR mit TBP (TATA box binding protein) als Referenzgen Protein-Expressionsniveaus von BCL2 und XIAP: Western Blot  primäre Antikörper: BCL2 - Klon 28, BD-Biosciences; XIAP - Klon 124, Dako; Referenz: β-Aktin (Sigma); Sekundärantikörper: Anti-Mausimmunoglobine HRP (Dako) Zellzahl als Maß für die Wachstumshemmung Apoptoserate: Annexin V-Propidiumiodid-Färbung Ein wichtiges Ereignis in der Tumorentstehung ist die Fehlregulation des natürlichen Zelltodes (Apoptose), welche insbesondere durch die Überexpression antiapoptotischer Gene, wie z.B. Survivin (SVV), XIAP, BCL2 und BCL-XL, gekennzeichnet ist. Die gezielte, gleichzeitige Hemmung dieser Gene, z.B. mittels „small-interfering RNAs“ (siRNAs), könnte eine geeignete Option zur Therapie des Blasenkarzinoms (BCa) darstellen. Abb. 3: Zellzahl relativ zur ns-siRNA-Kontrolle in EJ28-Zellen, 72h nach Transfektion. Abb. 4: Apoptoserate relativ zur ns-siRNA-Kontrolle in EJ28-Zellen, 72h nach Transfektion. Ergebnisse Die mRNA-Expressionsniveaus der Zielgene konnten sowohl in den Einzel-siRNA-Behandlungen als auch in den Kombinations-behandlungen deutlich reduziert werden (Abb. 1). Einzel- und Kombinationsbehandlungen bewirken vergleichbare Hemmraten. Für BCL2 und XIAP wurde auch auf Proteinebene eine signifikante Expressionsreduktion nachgewiesen (Abb. 2). Die Hemmung von SVV führte zur stärksten Reduktion der Zellzahl und zur Bildung multinukleärer Zellen (Abb. 3, 5). In den Kombinationsbehandlungen wurde eine höhere Apotoserate als in den Einzelbehandlungen festgestellt (Abb. 4) BCL2 (26 kDa) XIAP (57 kDa) β-Aktin (42 kDa) BCL2-D1 BCL2-D2 XIAP-D1 XIAP-D2 ns-siRNA unbehandelt A B Abb. 4: Bildung multinukleärer Zellen nach Survivin-Inhibition in EJ28-Zellen (A), 48 h nach Transfektion. Im Vergleich dazu unbehandelte EJ28 (B). 200-fache Vergrößerung. BCL2 (26 kDa) XIAP (57 kDa) β-Aktin (42 kDa) 4er-D1 4er-D2 8er ns-siRNA Schlussfolgerung Die kombinierte Hemmung von BCL2, BCL-XL, SVV und XIAP führt zur Senkung der mRNA-Expression aller Targets und verursacht eine höhere Apoptoseinduktion als die Einzel-siRNA-Behandlungen. Da Tumorzellen die Ausschaltung eines Apoptoseinhibitors durch Erhöhen der Expression eines anderen antiapoptotischen Genes umgehen können, könnte die gleichzeitige Ausschaltung mehrerer Apoptose-relevanter Gene eine vielversprechendere BCa-Therapieoption darstellen. Abb. 2: Reduktion der BCL2- und XIAP-Proteinniveaus in Einzel- und Kombinationsbehandlungen in EJ28-Zellen, 48h nach Transfektion. . Gefördert durch die Else Kröner Fresenius-Stiftung. Referenznummer 106-162502554-48 Abb. 1: Reduktion der Target-mRNA-Expressionsniveaus in Einzel- und Kombinationsbehandlungen in EJ28-Zellen, 48h nach Transfektion.