Isolation of cDNA clones encoding T cell- specific membrane-associated proteins 01.03.2010 Matthias Weißkopf 1 Sequence relationships between putative.

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1 Isolation of cDNA clones encoding T cell- specific membrane-associated proteins 01.03.2010 Matthias Weißkopf 1 Sequence relationships between putative T-cell receptor polypeptides and immunoglobulins Mark M. Davis, et al. Nature Vol. 308, March 1984

2 Gliederung Ausgangspunkt Ziel des Versuchs Methoden Ergebnis / Zusammenfassung Heutiger Stand 2

3 Stand der Dinge (1984) T-Zellen erkennen Antigene anders als B-Zellen und in einem anderen Zusammenhang Struktur von Immunglobulinen bekannt Identifikation des T-Zell Rezeptor Proteins, u.a. von Jim Allison Heterodimer über Disulfidbrücken verbunden Besteht aus konstanten und variablen Regionen 3

4 Ziel des Versuchs Isolierung der Gene, die für den T-Zell Antigen Rezeptor kodieren Vier Annahmen zur Identifikation wurden aufgestellt. Die Gene müssen: ausschließlich in T- und nicht in B Zellen exprimiert werden membrangebunden sein von Genen kodiert werden die sich neu anordnen, wie jene bei Immunglobulinen aus konstanten und variablen Bereichen bestehen. 4

5 Isolierung von T-Zell spezifischer mRNA Methoden 5 T-Zelle Isolierung der mRNA von membrangebunden Polysomen cDNA erstellen 5 3 5353 3535 d b a c a b c d

6 Isolierung von T-Zell spezifischer mRNA 6 B-Zelle b a c d a b c e e f Hybridisierung mit Überschuss an B-Zell mRNA

7 Trennung von Einzel- und Doppelsträngen per Hydroxyapatit Säule Weitere Eingrenzung durch Hybridisierung mit ähnlich hergestellter T-Zell cDNA Probe cDNA Fragmente wie d und f mögliche Kandidaten für T- Zell Rezeptor Einklonieren der cDNA in Plasmide -> etwa 30 TM Klone Isolierung von T-Zell spezifischer mRNA 7 d f d

8 Hybridisierung an genomische DNA aus Leber- und T-Zellen Radioaktiv markierte Inserts aus den Klonen als Sonde Verdau mit Pvu II -> Southern Blot Überprüfen von somatischer Rekombination 8

9 Insert aus TM86 besitzt anderes Muster Somatische Rekombination findet statt Annahme: Rekombination des Rezeptorgens unterscheidet sich bei T- Zellen unterschiedlicher Antigenspezifität Überprüfung durch Hybridisierung mit Insert von TM86 Überprüfen von somatischer Rekombination 9

10 10 Unterschiedliche Bindemuster in allen untersuchten T-Zelllinien B-Zellen besitzen selbes Muster wie Leberzellen -> Diese Art von Rekombination findet nur in T-Zellen statt

11 Screening von Thymozyten mit TM86 für weitere gleichartige Klone 86T1, 86T3 und 86T5 Sequenzierung der Thymusklone zeigt Genstruktur mit variablen und konstanten Bereich Starke Ähnlichkeit zu Immunglobulinen Variable, Konstante und Joining Regionen Strukturanalyse zeigt Transmembran Abschnitt Sequenzierung des Gens 11

12 Sequenzanalyse 12

13 TM86 ähnliche mRNAs kodieren für eine Kette des T-Zell Rezeptors (β-Kette) Unterschiedliche Anordnung von Genen je nach Antigenspezifität -> somatische Rekombination auf DNA Ebene Ähnlichkeit im Aufbau zu Immunglobulinen Vorausgesagte Struktur der Kette: Ergebnis / Zusammenfassung 13

14 Heutiger Stand 14 Quelle: Janeway

15 Vielen Dank für die Aufmerksamkeit ! 15