MRNA-Expressionsprofilierung und Normalisierung: QPCR-Erfahrungen und Ergebnisse einer retrospektiven Studie an 106 primären Prostatakarzinom-Gewebepaaren.

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1 mRNA-Expressionsprofilierung und Normalisierung: QPCR-Erfahrungen und Ergebnisse einer retrospektiven Studie an 106 primären Prostatakarzinom-Gewebepaaren Meye A1, Schmidt U1, Füssel S1, Koch R2, Baretton G3, Lohse A1, Tomasetti S1, Fröhner1 M, Wirth MP1 1Klinik für Urologie, 2Institut für Medizinische Informatik und Biometrie, 3Institut für Pathologie, TU Dresden

2 Agenda Heterogenität des PCa Überblick zu neuen molekularen Marker
Design einer SOP-QPCR-Studie erste Resultate zu 9 PCa-assoziierten Genen Arbeitshypothese: Vorhersagbarkeit organbegrenzter PCa anhand von gemeinsam überexprimierten mRNA-Markern Transferierbarkeit der Studien auf Biopsien Folie 2 / 20

3 ÜLZ in Abhängigkeit vom Stadium
Relatives Überleben (5/10 Jahre) Nach Diagnosezeitraum PCa-Mortalität in den USA (Land mit hohem PSA-Screeninganteil) Folie 3 / 20

4 Prognostizierte Verbesserung des Überlebens im Falle einer Früherkennung (SEER-Daten 1990-99)
Karzinom Lokalisierte Tumoren bei Detektion (%) 5-JÜR (%) 5-JÜR, wenn alle Fälle bei Detektion lokalisierte Tumoren wären (%) Kolon-Ca 41 64 90 Lungen-Ca 19 16 49 Brust-Ca 65 87 97 PCa 100  Suche nach neuen, besseren bzw. PSA-ergänzenden Markern zum PCa-Screening Folie 4 / 20

5 Marker-basiertes PCa-Progressionsmodell
 EZH2 (ÜE) [Gonzalgo & Isaacs 2003]  >100 Genkandidaten für das PCa postuliert (<30 unabhängig validiert) Folie 5 / 20

6 Arbeitsaufgaben QPCR-Studien
vergleichende retrospektive Analyse bekannter und neuer Transkriptmarker (n=9; all mit ÜE, ohne Mikrodissektion!) an repräsentativen PCa-Patientenkollektiv Übertragbarkeit der Resultate auf andere, minimalisierte Untersuchungsmaterialien Folie 6 / 20

7 Patienten & Gewebeproben
Gewebepaare von 106 RPEs (Tu >60%, Tf <10%) Charakteristika der PCa-Patienten (alle cM0): medianes OP-Alter 64 J (48-78 J.) 59 (56%) pT2, 47 (44%) pT3/pT4 92 (87%) pN0, 14 (13% pN1) 28 (26%) GS<7, 51 (48%) GS7, 27 (25%) GS8 alle ohne hormonelle Vorbehandlung mediane Serum-PSA (prä-OP) 8.3 ng/mL 29 (27%) adjuvant therapiert (= „treatment failure“) Follow-up der anderen 77 (23%) 32 Mon. (2-84) 10 mit PSA-Rezidiv (>0,2 ng/ml ) 67 ohne PSA-Rez. (im Median nach 35, Mon.) Folie 7 / 20

8 QPCR-Logistik (Ablaufplan)
30-60 Gefrierschnitte (10µm) in Lysepuffer Spin Tissue RNA Mini Kit (Invitek, Berlin) 2X RT parallel (je 0,5 µg; Superscript II, Invitrogen) cDNA poolen & LC-PCR mit 1:5 Verdünnung (20µl Aliquots, bei 4°C, nicht wegfrieren!) in 14/106 Fällen RNA-Mengen <1µg Bezug aller Expressions-Rohdaten auf RNA-Menge alle 13 Assays mit spez. Detektion (HP, TaqMan probes) unabh. Doppelbestimmung (bei >30% Abw. 3. Messung) Qualitätskriterien: DNA-Standards (10E1-10E7), +/- Kontr. Folie 8 / 20

9 PCR-Bearbeitungsstrategie
11 Gewebepaare pro LC-Lauf gemeinsam extrahierte und umgeschriebene Probenrunden Sammlung von kompletten Wiederholungs- läufen (divergierende Doppelmessung) ohne Wiederholungen 336 PCRs/Gen keine Normalverteilung der relativen Expressionswerte  Logarithmierung der Daten Folie 9 / 20

10 Statistische Verfahren
“receiver-operating characteristic” (ROC) Kurven “area under curve” (AUC) als Maß für die Rate korrekter Diagnosen Analyse & diagnostische Aussagekraft der Einzelvariablen (individuelle Transkripte) diagnostische Regel nach Multivariatanalyse (via AUC) Folie 10 / 20

11 Resultat 1: QPCR-Standardisierung
Anstieg Standardkalibrierung (GAPDH) (TBP) Korrelationskoeffizient >0,999 % ( 23 PCR-Läufe/Gen) mediane Standardabweichungen 8-14 % Folie 11 / 20

12 alle QPCR-Assays hoch reproduzierbar
Folie 12 / 20

13 Resultat 2: Referenzgen-Auswahl
p=0.038 p=0.036 p= p=0.531 Tf Tu Tf Tu Tf Tu Tf Tu GAPDH HPRT PBGD TBP Verwendung von TBP für relative Normierung der Expressionsdaten (& RNA-Mengen) Folie 13 / 20

14 Resultat 3A: relative Expressionswerte Tu & Tf
EZH2 mit geringstem & PSA mit höchstem Niveau (zmol Gen/ zmol TBP) variable Genexpression (2-5 Log-Stufen/Gen) relativ geringe mRNA-Levels in allen PCa-Zellinien Folie 14 / 20

15 Resultat 3B: log relative Expression Tu & Tf
Folie 15 / 20

16 Resultat 4: Tu:Tf Ratios
Höchste Überexpressionen für: DD3 (>40-fach im Median) & TrpM8 (>4-fach im Median) Folie 16 / 20

17 Resultat 5A: Subgruppenanalyse OC vs. NOC (vs. Tf)
Verwendbarkeit einzelner Marker zur Vorhersage organbegrenzter PCa??? Folie 17 / 20

18 Resultat 5B: Subgruppenanalyse lGS vs. hGS (vs. Tf)
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19 Resultat 5C: Subgruppenanalyse lGS vs. hGS (vs. Tf)
Folie 19 / 20

20 Folie 20 / 20

21 Diagnostische Regel eines Logit-Modells
zur PCa-Vorhersage Beispielrechnung für Patient 1: p=Wahrscheinlichkeit für ein PCa leitet sich aus folgender Transformation ab: p = exp(logit)/[1+exp(logit)] = exp(2.298)/[1+exp(2.298)] = 0.909 = 99,9% Tf-Expression: Prostein/TBP=2,01, EZH2/TBP=1,17, TRPM8/TBP=1,86, DD3/PCA3/TBP=0,396  p für Tu =6,9%, d.h. 93,1% (=100%-6,9%) Wahrscheinlichkeit eines TF Folie 21 / 20

22 Einzelmarker (DD3) vs. Kombination
Folie 22 / 20

23 Weitere Schritte Gewebepaare
Erweiterung des Patientenkollektivs auf 150 Patienten (cDNA-Bank!) Messung von weiteren PCa-assoziierten Markern, ggf. Integration in das Modell Definition eines relevanten Panels (max. 5 Marker) Vgl. der mRNA-Expressionsmuster mit CGH-Profilen zu definierender Subgruppen (Kooperation Homburg) prospektive Reevaluierung geeigneter Marker (Biopsiestudie) Folie 23 / 20

24 Reevaluierung an Biopsiematerial
„Simulation“ diagnostischer Stanzen am RPE-Präparat Gefrierkonservierung der Biopsien Schnitte systematisch für H&E und RNA-Extraktion Verwendung der Biopsien für QPCR bei primärer Nachweisbarkeit von >50 Molekülen TBP absolut Markerpanel: PSA, Trp-M8, Prostein, EZH2, DD3 cDNA-Menge aus 1/8 bis 1/16 Biopsieteil ausreichend Folie 24 / 20

25 QPCR an Biopsien Folie 25 / 20

26 6-Markerbestimmung aus Gesamtbiopsien
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27 Hypothetisches Modell für differentiell exprimierte PCa-Transkriptmarker
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28 Vision - additives molekulares Staging
Anwendungsgebiete PCa: Stanzbiopsie, LN-Gewebe Serum-/Blut-, Urinprobe Disseminierte Tumorzellen, Mikrometastasen Identifizierung von Patienten mit niedrigem Progressionsrisiko („watchful waiting“) Target-spezifische(re) Therapieoptionen (auf Grundlage einer molekularen Charakterisierung des Individualtumors) 15-20mm,  0,8 mm Routinepathologie & & molekulare Diagnostik Folie 28 / 20

29 Kenntnisstand molekulargenetische PCa-Marker
tumorbiologische Heterogenität basiert auch auf einer extremen genetischen Diversität dieser Ca-Entität (kein „PCa-Gen“) hoffnungsvolle Marker (Prostata- oder/und PCa-spezifisch) mit diagn. & progn. Potential identifiziert („post-PSA-Zeit“) einige gleichzeitig mögliche Therapietargets (z.B. Immuntherapie) Testung molekular-basierter, modifizierbarer Therapiestrategien extensive Evaluierung der klinischen Test-Wertigkeiten notwendig klinische Anwendung additiver molekularer Markermuster für frühzeitige Diagnosemöglichkeit (Screening-Marker) individuellere Prognoseabschätzung & Therapieentscheidung Abschätzung eines patientenspezifischen Therapieansprechens Folie 29 / 20

30 Marker 1: DD3PCA3 (uPM3TM)-Transkript
„differential display code 3“, 9p21-22 [Bussemaker et al. 1999] Gen mit der bisher höchsten bekannten PCa-Spezifität (RT-PCR) identifiziert als fach überexprimiert (Northern) in 53/56 PCa- Geweben (0/56 korrespondierenden Tf-Prostategeweben) nichtkodierende mRNA der Prostata-Epithelzellen im Median 66-fache ÜE (QPCR, Detektierbarkeit bei <10% Tu-Anteil) DD3PCA3 im Urin (20-30mL) nach rektaler Palpation nachweisbar relative mRNA-Expression von DD3PCA3 & PSA via QPCR kurzfristige Kommerzialisierung (DiagnoCure, Quebec) für 80 Mio. US$ Patent, >40 Mitarbeiter an Assay-Entwicklung & Validierung Übernahme durch 2 Diagnostikfirmen (Genprobe, Bostwick Laboratories) Folie 30 / 20

31 Marker 5: EZH2 (ÜE im HRPC)
„polycomb group protein enhancer of zeste homolog 2“ transkriptioneller Repressor („zelluläre Identität“) spezifisch in HRPC überexprimiert (mRNA & Protein) insbesondere in metastatische PCa erhöhte Expression PCa mit einer EZH2-ÜE ~ direkt mit geringer ÜLZ (nicht mit GS oder Tumorstadium)  unabhängige prognostische Relevanz ÜE-Detektion im Gewebe = negativer Prognoseprädiktor experimentelle EZH2-Blockade (siRNA) in PCa-Zellinien:  Viabilitäts- & Wachstum  (aber keine Apoptose) Folie 31 / 20