an humanen Harnblasenkarzinomzelllinien Institut für Biochemie Fakultät Mathematik und Naturwissenschaften Technische Universität Dresden Klinik und Poliklinik für Urologie Universitätsklinikum Carl Gustav Carus Technische Universität Dresden in Kooperation mit Untersuchungen zur Multitarget-Geninhibierung durch Nukleinsäurekonstrukte an humanen Harnblasenkarzinomzelllinien Yvonne Burmeister Dresden, 21.07.2005

- Überblick - • Einleitung: BCa, Targets: hTERT, SVV, VEGF siRNA & AS-ODN • Ziel- und Aufgabenstellung • Ergebnisse • Zusammenfassende Bewertung und Ausblick 2

- Das Harnblasenkarzinom - Vierthäufigster Tumor bei Männern Siebthäufigste Krebstodesursache in Deutschland Männer sind ca. 3 häufiger betroffen als Frauen 17.500 Neuerkrankungen pro Jahr in Deutschland Gehäuftes Auftreten im Alter (Durchschnittsalter zum Diagnosezeitpunkt: 65 J.) Einleitung 3

- Therapie des Harnblasenkarzinom (BCa) - Oberflächliches BCa Transurethrale Resektion des Rezidivhäufigkeit (50-70%) Blasentumors (TURB) Progressionsrisiko (10-20%) Muskelinvasives BCa Zystektomie (Blasenentfernung) geringe Überlebensrate Zusätzlich: Chemo-, Strahlen-, Immuntherapie, Kombinationsbehandlungen 1 carcinoma in situ 2/3 papilläres Karzinom 4 Infiltration in die oberflächliche Muskulatur 5 Befall der tiefen Muskulatur 6/7/8 Ausdehnung durch die Blasenwand http://www.cytochemia.de/HomePage_CC/Pat_Ind/Carcinome/carcinome.html Suche nach alternativen oder/und additiven Therapieformen Einleitung 4

- Tumor- und BCa-relevante Targets - Humane Verlängerung - in > 90% aller Tumore, Telomerase Reverse und einschließlich des BCas, kann eine Transkriptase Stabilisierung Telomeraseaktivität nachgewiesen (hTERT) der Telomere werden Survivin Apoptose- - vierthäufigstes Transkript in (SVV) inhibitor malignen Tumoren - Korrelation mit Tumorgrad, Rezidivierung und Überleben Vaskulärer Angiogenese- - VEGF-Überexpression in endothelialer faktor zahlreichen Tumoren Wachstumsfaktor - Korrelation mit Tumorprogression (VEGF) Einleitung 5

- Techniken der Geninhibierung - Antisense-Oligodesoxynukleotide (AS-ODN) small interfering RNA (siRNA) Einleitung 6

- Aufgaben- & Zielstellung - 1. AS-ODN-Kombinationstherapie in vitro hTERT + SVV + VEGF 2. Entwicklung einer siRNA gegen VEGF 3. siRNA-Kombinationstherapie in vitro hTERT + SVV + ? 4. siRNA gegen VEGF + Chemotherapeutika Erhöhung der Wirkung der Behandlung mit Einzelkonstrukten? Steigerung der Effektivität herkömmlicher Chemotherapeutika? 7

- Behandlungs- und Bewertungsschema für die Kombinationen - Nonsense-Konstrukt (NS-K) unbehandelte Zellen hTERT + SVV hTERT + VEGF SVV + VEGF hTERT + NS-K SVV + NS-K VEGF + NS-K hTERT SVV VEGF 8

keine Verstärkung der Wirkeffekte - Kombination der AS-ODN gegen hTERT, SVV und VEGF - WST-1-Viabilitätstest kombinationsbehandelter EJ28-Zellen 24 h post Trf 48 h post Trf 72 h post Trf keine Verstärkung der Wirkeffekte Ergebnisse 9

- Kombination der AS-ODN gegen hTERT, SVV und VEGF - Behandlung Gesamtapoptose ASt2331 33,0 % ASsvv286 21,3 % ASvegf857 30,9 % NS-K1 12,1 % ASt2331 + NS-K1 30,1 % ASsvv286 + NS-K1 24,0 % Asvegf + NS-K1 24,8 % ASt2331 + ASsvv286 29,3 % ASt2331 + ASvegf857 27,4 % ASsvv286 + ASvegf857 24,1 % unbehandelte Zellen 7,1 % EJ28 Apoptoseraten Zellzahl Langzeitproliferation Zellzyklusverteilung zweite Zelllinie (5637) keine zunehmenden antiproliferativen Effekte in keiner der beiden Zelllinien bei keiner Methodik Ergebnisse 10

- Testung und Charakterisierung einer siRNA gegen VEGF - siVEGF203 Takei et al., 2004 siVEGF437 Filleur et al., 2003 siVEGF865 Zeit- und Konzentrationsabhängigkeit nachgewiesene Wirksamkeit bis zu 72h bereits bei 200nM Systematische Charakterisierung in drei BCa-Zelllinien siVEGF865 Zelllinie EJ28 5637 RT112 VEGF-mRNA -65 % -75 % -70 % VEGF-Protein -50 % keinen Einfluss auf das Zellwachstum (Viabilität, Langzeitproliferation, Apoptose, Zellzyklusverteilung) effektive, reproduzierbare Inhibierung von VEGF jedoch keine wachstumsinhibitorischen Effekte Ergebnisse 11

- Kombination der siRNA gegen hTERT, SVV und VEGF - WST-1-Viabilitätstest EJ28-Zellen 5637-Zellen RT112-Zellen - keine Verstärkungseffekte verstärkende Effekte abhängig von der Zelllinie Ergebnisse 12

- Kombination von siVEGF mit Chemotherapeutika - WST-1-Viabilitätstest von 5637-Zellen + MMC-1 + MMC-2 + CDDP-1 + CDDP-2 + GEM-1 + GEM-2 Chemosensitivierung von BCa-Zellen Ergebnisse 13

- Kombination von siVEGF mit Chemotherapeutika -   - Kombination von siVEGF mit Chemotherapeutika - Signifikante Unterschiede der Zellviabilität [p<0,05 (+), p<0,01 (++), p<0,001 (+++)] Zelllinie siRNA MMC-1 MMC-2 CDDP-1 CDDP-2 GEM-1 GEM-2 EJ28 siVEGF865 - ++ +++ siVEGF437 + siVEGF203 5637 RT112 Chemosensitivierende Wirkung aller Konstrukte abhängig von Zelllinie und Chemotherapeutikum Ergebnisse 14

- Zusammenfassende Bewertung - 1. AS-ODN-Kombinationstherapie hTERT / SVV / VEGF 2. siRNA gegen VEGF 3. siRNA-Kombinationstherapie 4. siVEGF + Chemotherapeutika keine Verstärkung der Wirkeffekte reproduzierbare Inhibierung von VEGF ohne wachstumsinhibitorische Effekte Verstärkungseffekte abhängig von der Zelllinie Chemosensitivierende Wirkung der Konstrukte abhängig von Zelllinie und Chemotherapeutikum 15

Xenotransplantatmodell - Ausblick - 1. AS-ODN- Kombinationstherapie 2. siRNA gegen VEGF 3. siRNA- 4. Kombination von siVEGF und Chemotherapeutika - Dreierkombination in vitro - in vivo-Studien ausführliche in vitro-Charakterisierung in vivo-Studien Xenotransplantatmodell Harnblase orthotop subkutan 16

Vielen Dank an die Mitarbeiter des Urologischen Forschungslabors und alle weiteren Personen, die mich bei der Anfertigung der Diplomarbeit unterstützten!

- Chemotherapeutika -       Mitomycin C Cisplatin Gemcitabin

- Methoden - ASt2331+ASvegf857- NS-K1-behandelte   ASt2331+ASvegf857- behandelte 5637-Zellen NS-K1-behandelte 5637-Zellen G0/G1-Phase 47,48 % G0/G1-Phase 59,75 % Sub-G0-Peak S-Phase 37,06 % S-Phase 27,89 % G2/M-Phase 15,46 % G2/M-Phase 12.37 %

- Methoden -   D C A B

- Methoden -  

Vergleich der mRNA-Expression Target Vergleich der mRNA-Expression Referenzen SVV-mRNA EJ28 (++++) > 5637 (+++) > RT112 (++) Fuessel et al., 2004 VEGF-mRNA EJ28 (++++) > 5637 (++) > RT112 (++) Krause et al., 2005 hTERT-mRNA EJ28 (++++) > 5637 (+) > RT112 (+) Kraemer, pers. Mitteilung   EJ28 5637 mRNA-Expression hTERT SVV VEGF ASt2331+ASsvv286 ↓ - ↑ ASt2331+ASvegf857 ASsvv286+ASvegf857