CRISPR/Cas9 Gentechnik Gezieltes einbringen in MO, Knock out, Golden (carotin), Somatischen gentherapie Insertion Deletion Virenbasierte systeme (homologe rekombination – 1000 bp) CRISPR Cas … Schutz Bakterien vor Virusangriffen Gentechnik

Integration großer DNA-Fragmente in E.coli mittels CRISPR/Cas9 Crispr cas für DSB  system für homologe rekombination benötigt  lambda red Sarah Haenelt

λ-Red – Anwendung in der Gentechnik Donor-DNA Gam ApR pλRed (pKD46) Gam Beta Exo Exo Beta Lambda red bacteriophage Exo… Beta… schützt ssDNA und erleichtert anlagerung Gam… verdau donor dna durch nukleasen target-DNA 09.11.2018 Sarah Haenelt, Seminar Biotechnologie

CRISPR/Cas9 – ein effektives System zum Schutz vor Viren tracr-RNA CmR pCas9 tracrRNA cas9 Cas9-Protein CRISPR/Cas9-Komplex crRNA pCRISPR ᶲ KmR Cm…Chloramphenicol CRISPR-RNA 09.11.2018 Sarah Haenelt, Seminar Biotechnologie

CRISPR/Cas9 – ein effektives System zum Schutz vor Viren target DNA Doppelstrangbruch CRISPR/Cas9-Komplex 09.11.2018 Sarah Haenelt, Seminar Biotechnologie

Induktion von Doppelstrangbrüchen in E.coli MG1655 Lac Z Lac Z tracr-RNA tracr-RNA KmR CmR pCas9 tracrRNA cas9 Cas9-Protein CmR pCas9 tracrRNA cas9 Cas9-Protein KmR pCRISPR lacZ pCRISPR ∆crRNA CRISPR-RNA mit LacZ-Seq. Lac Z crRNA (lacZ-Seq.) tracr-RNA CmR pCas9 tracrRNA cas9 Cas9-Protein KmR pCRISPR ᶲ CRISPR-RNA ohne LacZ-Seq. crRNA 09.11.2018 Sarah Haenelt, Seminar Biotechnologie

Die SOS-Antwort der Zelle Lac Z CmR pCas9 tracrRNA cas9 crRNA (LacZ) KmR pCRISPR LacZ recA umuDC Lac Z CmR pCas9 tracrRNA cas9 crRNA (LacZ) KmR pCRISPR LacZ recA Lac Z CmR pCas9 tracrRNA cas9 crRNA (LacZ) KmR pCRISPR LacZ umuDC WT ∆umuDC ∆recA umuDC … DNA-Pol V 09.11.2018 Sarah Haenelt, Seminar Biotechnologie

Homologe Rekombination im E.coli MG1655 Wiltyp recA Lac Z HRL HRR Lac Z HRL HRR pCas9 pCRISPR LacZ pλRed HRL HRR TcR CRISPR/Cas9-System Wildtyp pλRed Lac Z HRL HRR recA TcR HRL … homologer Arm links HRR … homologer Arm rechts Je ca. 50 bp lang λ-Red-Kontrolle 09.11.2018 Sarah Haenelt, Seminar Biotechnologie

Homologe Rekombination in der E.coli ∆recA-Mutante pCas9 pCRISPR LacZ pλRed Lac Z HRL HRR TcR CRISPR/Cas9-System ∆recA-Mutante recA Kontrolle λ-Red pλRed Lac Z HRL HRR TcR λ-Red-Kontrolle 09.11.2018 Sarah Haenelt, Seminar Biotechnologie

Homologe Rekombination großer DNA-Abschnitte TcR HRL HRR 1.4 kb TcR TcR HRL HRL HRR 2.4 kb Spacer Spacer TcR HRL HRR 3.9 kb Spacer TcR HRL HRR 5.4 kb Spacer TcR HRL HRR 7.0 kb Spacer HRL … homologer Arm links HRR … homologer Arm rechts 09.11.2018 Sarah Haenelt, Seminar Biotechnologie

Homologe Rekombination in anderen E.coli-Stämmen E. coli BL21 (DE3) E. coli W 09.11.2018 Sarah Haenelt, Seminar Biotechnologie

Sarah Haenelt, Seminar Biotechnologie Zusammenfassung CRISPR/Cas9 ist ein effektives System zur Induktion von Doppelstrangbrüchen CRISPR/Cas9 ermöglicht Einbau von Sequenzen bis zu einer Länge von 7 kb in das E.coli-Genom (Rekombinationseffizienz von 61 %) Das Ausschalten des recA-Gens erhöht die Effizienz des Einbaus Die Rekombinationseffizienz unterscheidet sich deutlich zwischen unterschiedlichen E.coli-Stämmen 09.11.2018 Sarah Haenelt, Seminar Biotechnologie

Sarah Haenelt, Seminar Biotechnologie Literatur Chung Mu-En, Yeh I-Hsin, Sung Li-Yu, et al. (2017): Enhanced Integration of Large DNA Into E. coli Chromosome by CRISPR/Cas9. Biotechnology and Bioengineering, 114 (1), S.172-183 Anthony R. Poteete (2001): What makes the bacteriophage λ Red system useful for genetic engineering: molecular mechanism and biological function. FEMS Microbiology Letters, 201 (1), S.9-14 Le Cong, Ann Ran F., Cox David, et al. (2013): Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems. Science, 339 (6121), S.819- 823 09.11.2018 Sarah Haenelt, Seminar Biotechnologie

Vielen Dank für die Aufmerksamkeit! Noch Fragen? Vielen Dank für die Aufmerksamkeit! 09.11.2018 Sarah Haenelt, Seminar Biotechnologie