Supplemental Material

Präsentation zum Thema: "Supplemental Material"—  Präsentation transkript:

1 Supplemental Material
Role of λ5 in B Cell Development Kitamura et al. 1992 Supplemental Material

2 Homologe Rekombination
Wildtype Zielgen Deletions- vektor Neo TKHSV Rekombi- nierter Lokus Neo

3 Acyclovir (Zovirax®) Wirkungsmechanismus Struktur
Acyclovir, ein Purinanalog, hat hohe Affinität zu viraler TK Acyclovir wird durch Thymidinkinase phos- phoryliert und als Nukleotidanalog in DNA eingebaut DNA Elongation wird terminiert

4 Selektion gegen zufällige Integration
Zielgen Zufällige, partielle Insertion des Vektors Homologe Rekombination Neo TKHSV Neo Neo TK Zufällige Insertion des gesamten Vektors Neo+ TKHSV- Neo+ TKHSV- Neo TKHSV Neo+ TKHSV+

5 Homologe Rekombination
Wildtype Zielgen Deletions- vektor Neo Rekombi- nierter Lokus Neo

6 Konstruktion des λ5 Deletions-Vektor
Wildtyp- Lokus „Promoter“-Deletion Kloniertes Fragment Vektor neo „Neo“- Insertion neo Deletions- vektor

7 Homologe Rekombination
Wildtyp- Lokus Deletions- vektor neo Deletierter Lokus neo PCR

8 Knockout Mäuse Blastozyteninjektion

9 Chimäre Mäuse Chimäre Agouti-Maus
Main Entry: agou·ti Pronunciation: &-'gü-tE Function: noun Etymology: French, from Spanish agutí, from Tupi Date: 1625 1 : any of a genus (Dasyprocta) of tropical American rodents about the size of a rabbit 2 : a grizzled color of fur resulting from the barring of each hair in several alternate dark and light bands Chimäre Agouti-Maus

10 Southernblotanalyse von Maus-DNA
EcoRI EcoRI EcoRI EcoRI EcoRI 10.2 7.5 2.5 neo Sonden 1 2 1 2

11 Von der chimären zur hetero- und homozygoten Knockout-Maus
C57Bl6 Rag2-/- F1 (nicht nach Mendel) Rag2-/- Rag2-/- Rag2-/-

12 Oberflächenmarker zur Bestimmung des Differenzierungsstadiums
IgD IgM B220 V  J D  JH VH  DJH Stamm-zelle Frühe Pro-B- Zelle Späte Pro-B- Zelle Späte Prä-B- Zelle Unreife B-Zelle Reife B-Zelle Frühe Prä-B- Zelle Große Zellen Kleine Zellen

13 Lymphozyten in Blut und Milz +/ / /- Blut Milz Milz Milz

14 B-lymphoide Zellen im Knochenmark

15 Analyse der λ5-KO-Maus Wolfgang Schuh (Jäck Lab)

16 µ Bedeutung des Prä-B-Zellrezeptor für die Entwicklung
B-lymphoider Vorläuferzellen Igb-/- µm-/- l5-/- VpreB-/- µDys-/- JH-/- ) RAG-/- Prä-BZR IgM IgM IgD Stamm Prä-Pro Pro Frühe Prä- Späte Prä- Unreife Reife Plasma- Zelle B-Zelle B-Zelle B-Zelle B-Zelle B-Zelle B-Zelle zelle D  JH VH  DJH VL  JL CD19 c-kit CD25 B220 (CD45)

17 BM Bl/6 WT Rag2 KO l5 KO (7weeks) C-kit CD19 25,13 6.97 10,4 14,17
0,09 7,56 CD25 CD19 27,37 2,2 8,7 CD19 IgM

18 Spleen Bl/6 WT Rag2 KO l5 KO(7weeks) 47,7 0,1 16,6 CD19 IgM CD4 CD8

19 Serum-Ig

20 Humorale Immunantwort
T-unabhängig T-abhängig

21 B-lymphoide Zelle im Peritoneum

22 Allelausschluss -/- +/+ Methode: Photoimmunfluoreszenz

23 Iso-, Allo- Idiotypic Markers
Durch Immunisieren z.B. eines Kaninchens mit gereinigtem Maus-IgM aus einer weißen Maus = BALB/c wird die Produktion folgender Kaninchen-Antikörper induziert. BALB/c (μa) C57Bl/6 (μb) Anti-allotypische AK (gegen ein bestimmtes Epitop In C-Region) Anti-isotypische AK (gegen Epitope in C-Regionen der H- und L-Kette) Anti-idiotypische AK (gegen Epitope in V-Regionen der H- und L-Kette)

24 ? ? ? Initiierung von Prä-B-Zellrezeptorsignalen?? Ligand cytoplasm
Konstitutiv vom ER Konstitutiv von der Zelloberfläche Liganden induziert Ligand ? ? cytoplasm ? cytoplasm cytoplasm ER ER ER