Grundübungen Mikrobiologie

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1 Grundübungen Mikrobiologie
(2. Woche; – ) Versuch IV: Bakteriophage Mu Versuch V: Transformation von Acinetobacter baylyi Fortführung Versuch II: Isolierung und Charakterisierung eines Enterobakteriums

2 6. Tag des Praktikums (Grundübungen Mikrobiologie)
Vorbereitung für den Phagenversuch mit dem Bakteriophagen Mu Vorbereitung für den Transformationsversuch Animpfen der beiden Vorkulturen (E. coli W3110 und EB143) für den Phagenversuch Ausstrich der Anreicherungskulturen auf EMB-Agar Neuer Ausstrich von E. coli, B. subtilis und P. fluorescens

3 VORBEREITUNGEN JEDE GRUPPE
500 ml LB-Medium werden angesetzt und wie folgt aufgeteilt: 10 Reagenzgläser mit Alukappe mit je 5 ml LB-Medium autoklavieren. Zwei 300-ml-Erlenmeyerkolben mit Schikanen und Alukappe mit je 30 ml LB- Medium autoklavieren NACH dem Autoklavieren STERIL in 1 Erlenmeyerkolben zugeben: 750 µl MgSO4 (0,1 M) und 600 µl Thymin (2,5 mg/ml) (Induktionsmedium) Eine 500-ml-Schottglasflasche mit 250 ml LB-Medium mit 3,7 g Agar autoklavieren NACH dem Autoklavieren und Abkühlen (ca. 50 °C): 10 Platten gießen einen 100-ml-Erlenmeyerkolben mit Alukappe und 50 ml LB-Medium autoklavieren NACH dem Autoklavieren STERIL zugeben: 125 µl MgSO4 (0,1 M) (Verdünnungsmedium)

4 VORBEREITUNGEN JEDE GRUPPE
2 leere Schraubdeckelröhrchen autoklavieren (Deckel LOSE aufsetzen!) 30 leere Reagenzgläser mit Alukappe autoklavieren 100 ml Saline in einer 200-ml-Schottglasflasche autoklavieren (0,9 %NaCl) sterile Glaspipetten (1 ml, 2 ml, 5 ml, 10 ml) vorbereiten sterile Eppendorfreaktionsgefäße sterile Spitzen (gelb, blau)

5 VORBEREITUNGEN PRO BOX (Je eine Gruppe setzt für ganze Box an!)
100 ml 0,1 M MgSO4 in einer 100-ml-Schottglasflasche 15 ml Thymin (2,5g/ml), STERILFILTRIEREN, d.h. leeres Schraubdeckelröhrchen mit lose aufgesetztem Schraubdeckel autoklavieren!!! 200 ml 10 mM MgSO4 in einer 400-ml-Schottglasflasche (aus der 0,1 M Lsg. ansetzen) Weichagar: 200 ml LB-Medium mit 1,4 g (0,7%) Agar in einer 500-ml- Schottglasflasche autoklavieren. NACH dem Autoklavieren: je 2,5 ml in 40 Reagenzgläser 30 Agarplatten Minimalmedium (1 l Medium ansetzen, zwei 1000-ml- Schottglasflaschen mit 7,5 g Agar befüllen und 500 ml Medium darauf geben)

6 VORBEREITUNGEN JEDE GRUPPE
Zwei 5 ml LB-Röhrchen mit E. coli beimpfen (E. coli W3110 und E. coli EB143), die Kulturen werden über Nacht bei 30oC auf dem Schüttler inkubiert Neuer Ausstrich der Anreicherungskultur auf EMB-Platte neuer Ausstrich E. coli, B. subtilis und P. fluorescens

7 Versuch IV: Bakteriophage Mu DNA-Injektionsmechanismus des Phagen T2
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8 Versuch IV: Bakteriophage Mu
Was sind Phagen? Definition: Bakterien-spezifische Viren (keine Pflanzen-, Tierviren) keine Lebewesen im eigentlichen Sinn Replikation nur mit Hilfe der Wirtszelle Größe 0,02 - 0,2 µm (Vergleich: Bakterien 0, µm) Genom 3, kbp enthalten DNA oder RNA doppelsträngig oder einzelsträngig z.T. Hülle = Capsid (Proteine, Zucker, Fette) bleibt extrazelullär, nur Infektion mit Nukleinsäure Phage Mu (Mutator) 37,2 kb ds DNA plus Wirts-DNA

9 Versuch IV: Bakteriophage Mu
virulente Phagen: Replikation und damit Phagenvermehrung direkt nach Infektion temperente Phagen Einbau der Phagen-DNA ins Wirtsgenom Prophage (keine Schädigung für Wirt) lysogene Wirtszelle (nicht geschädigt) spezifische Integration z.B. Phage λ über homologe Rekombination an definierter Stelle im Genom unspezifische Integration z.B. Phage Mu (Mutation, Mutator) über nicht- homologe Rekombination an undefinierter Stelle im Genom

10 Versuch IV: Bakteriophage Mu

11 Versuch IV: Bakteriophage Mu
beide Wege beginnen mit Integration ins Genom (1) lytischer Weg: replikative Transposition ( Kopien im Chromosom) (2) lysogener Weg: wie beschrieben Repressor kontrolliert Phagenvermehrung Phage Mu (hier Mutante des Phagen): temperatursensitiver Repressor d.h. 30 °C kein lytischer Zyklus 43 °C lytischer Zyklus

12 Versuch IV: Bacteriophage Mu
Transduktion Übertragung genetischen Materials von einer Bakterienzelle auf eine andere durch Bakteriophagen Bei manchen Phagen: Ausschneiden und Verpacken der DNA unter Mitnahme von Wirts-DNA: Transduktion z.B. Mu: Genom enthält immer ~39 kb (statt 37,2 kb) Spezifische Transduktion ( spez. DNA, Phage λ) Unspezifische Transduktion (unspez. DNA, Phage Mu)

13 Versuch IV: Bakteriophage Mu
Nachweis von Phagen: Plaquebildung Infektion eines für den Phagen sensitiven Bakterienstammes (Phagen-sensitiver Stamm) mit Phagenlysat (Phagen) Mischung Bakterienstamm mit Phagen Ausplattieren in Verdünnungsreihen A) geschlossener Bakterienrasen B) Plaques (Lysehöfe im Bakterienrasen) Infizierte Bakterien produzieren Lysehöfe im Bakterienrasen.

14 Versuch IV: Bakteriophage Mu
Was wollen Sie im Praktikum machen? Versuchsaufbau: Zur Verfügung gestellt werden 2 Bakterienstämme auf Agarplatten: E. coli EB143: lysogener Stamm (d.h. der Stamm trägt Phagen-DNA im Chromosom) Induktion des lytischen Zyklus und Herstellung des Phagenlysats (enthält Phagen) E. coli W3110: Phagen-sensitiver Stamm Infektion mit dem Phagenlysat und dadurch Plaques im Bakterienrasen

15 Versuch IV: Bacteriophage Mu
(1) lysogener Stamm (d. h. der Stamm trägt Phagen-DNA im Chromosom) 5 ml LB EB143 W3110 Von Platte: 1 Kolonie 30 ml LB + 0,75 ml 0,1 M MgSO4 + 0,6 ml Thymin 0,4 - 0,8 ml Induktion und Herstellung des Phagenlysats Infektion und Bestimmung der Konzentration an Phagenpartikeln 30 °C, Schüttler, OD600-Messung alle 45 min (2) Phagen-sensitiver Stamm

16 Versuch IV: Bacteriophage Mu
(1) lysogener Stamm (d.h. der Stamm trägt Phagen-DNA im Chromosom) Lebendzellzahl vor Lyse 0,5 ml 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 Je 4,5 ml Saline EB143 Bei OD600 ~ 0,8 Rest: 30 min bei 43 °C im Wasserbad, danach bei 37 °C auf Schüttler und alle 45 min OD600 messen Lebendzellzahl nach Lyse 10 ml Tropfen Chloroform, schütteln Abzentrifugieren und der Überstand ist: Phagenlysat 0,5 ml 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 Je 4,5 ml Saline (2) Phagen-sensitiver Stamm W3110 10 ml abzentrifugieren, Überstand verwerfen und Pellet in 10 ml 10 mM MgSO4 resuspendieren Bei RT lagern Bei OD600 ~ 1,0

17 Versuch IV: Bacteriophage Mu
Phagenlysat 10-8 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 Je 4,5 ml Verdünnungsmedium 2,5 ml Weichagar Phagentiter je 0,1 ml je 0,5 ml 10 min bei 37 °C im Wasserbad, NICHT SCHÜTTELN W3110 Bei OD600 ~ 1,0 sensitiver Stamm

18 Versuch IV: Bakteriophage Mu
Was wollen Sie mit dem Versuch bestimmen? Plaques im Bakterienrasen d. h. die Bakteriophagen (aus Phagenlysat) haben den Phagen-sensitiven Stamm befallen. Phagentiter (Anzahl der Phagenpartikel/ml Phagenlysat): Plaques! Zahl der Plaques x 10 x Faktor der zugehörigen Verdünnungsreihe Wurfgröße (Anzahl der pro Zelle freigesetzten Phagen): Phagentiter! Zahl der lysierten Zellen! Lebenzellzahl vor der Lyse - Lebendzellzahl nach der Lyse (aus entsprechenden Verdünnungsreihen, LZ x 10 x Faktor der entsprechenden Verdünnungsreihe) = Zahl der lysierten Zellen Phagentiter/Anzahl der lysierten Zellen