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Gelelektrophoreseam Isas SDS-Page 2D. SDS-PAGE Natrium – Dodecyl – Sulfat – Polyacrylamid Gelelektrophorese Kontinuierliche PAGE Diskontinuierliche PAGE.

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Präsentation zum Thema: "Gelelektrophoreseam Isas SDS-Page 2D. SDS-PAGE Natrium – Dodecyl – Sulfat – Polyacrylamid Gelelektrophorese Kontinuierliche PAGE Diskontinuierliche PAGE."—  Präsentation transkript:

1 Gelelektrophoreseam Isas SDS-Page 2D

2 SDS-PAGE Natrium – Dodecyl – Sulfat – Polyacrylamid Gelelektrophorese Kontinuierliche PAGE Diskontinuierliche PAGE Durch SDS Proteine entfaltet, 1 Nettoladung proportional zur Molekülgröße

3 2D -PAGE Separation der Proteine nach 2 physikalischen Parametern Auch orthogonale Seperation 1. Dim.: Separation durch isoelektrischen Punkt 2. Dim.: Separation nach elektrophoretischen Trennverfahren

4 Nachweißgrenze Molekülmasse Trennungskapazität Cells Proteine Peptide Aminosäuren

5 Arbeitsschema für 2D-PAGE IPG-strip 1. Dimension Probenbehälter pH 3.0 pH 10.0

6 Proteine wandern im elektrischen Feld zu ihren isoelektrischen Punkt + -

7

8 1. Dimension IPG-Strips: Im Handel erhältliche Gel-Streifen mit unmobilen und eingestellten pH- gradient (pH 3-10 )

9 Vorbereitung da Streifen im Schiff transportiert wurden sind diese dehydratisiert (längere Lagerung) Rehydratisierung ist nötig Für 24 cm Streifen sind 450 µL nötig Mischung aus – 8M Harnstoff – 2M Thioharnstoff – 2% CHAPS – 0.002% Bromphenol blau – 2% IPG-Puffer

10 Isoelektrische Fokusierung Assembly of IEF-System – Streifen in Vorrichtung (Streifenhalter) – Elektroden an das Gel anschließen – Proben aufs Gel/Streifen geben – Streifen mit Öl abdecken – Ungefähre Laufzeit 20h !!!!

11 Vorbereitung für 2 Dimension Re-puffering von IPG-Streifen Reduktion and Alkylierung Schritt Streifen auf 2 Gel packen und laden Gel mit Agarose Lösung auffüllen, so dass Streifen gut aufliegt

12 2. Dimension Ungefähre Laufzeit 4h

13 Färbung Colloidal Coomassie (G-250) – 34% Methanol – 2% Phosphorsäure – 17% Ammoniumsulfat – 0,066% Coomassie Silber Färbung


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