Biochemisches Praktikum für Biologen

Präsentation zum Thema: "Biochemisches Praktikum für Biologen"—  Präsentation transkript:

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2 Biochemisches Praktikum für Biologen
Institut für Biochemie Peter Friedhoff

3 Organisationsstufen in der Zelle

4 Bestandteile einer E. coli Zelle

5 Bestandteile einer E. coli Zelle

6 Proteinaufreinigung Funktion bekannt – Protein unbekannt Welches Protein ist für eine bestimmte Funktion verantwortlich? Protein bekannt – Funktion unbekannt Welche Funktion hat ein bestimmtes Protein?

7 Aufreinigung von Proteinen
Proteineigenschaften Stabilität Löslichkeit Ladung Hydrophobizität Größe/Form/Masse spezifische Interaktionen (Affinität) Verfahren Zellaufschluß Pufferbedingungen Zentrifugation Fällung Dialyse Säulenchromatographie

8 Charakterisierung von Proteinen
Aktivitätsassay (z.B. enzymatische Aktivität) Elektrophorese (1-D/2-D) (IEP/Masse) Spektroskopische Methoden (Funktion/Struktur) Massenspektrometrie (Masse/Sequenz) Edman-Sequenzierung (Sequenz) Röntgenstrukturanalyse/NMR (Struktur)

9 Aufreinigungsprotokoll von Proteinen

10 Aufreinigung von Rattenleber Glucokinase
Page 142 © 2004 John Wiley & Sons, Inc. Voet Biochemistry 3e

11 Zentrifugation

12 Dialyse Dialysemembran lässt nur kleine Moleküle hindurch (z.B. Mr < 5000) Makromoleküle werden zurückgehalten Anwendung: Pufferwechsel

13 Säulenchromatographie
Substanzen gelöste in mobiler Phase durchlaufen eine stationäre Phase. Wechselwirkung (Verteilung oder Adsorption) mit der Matrix bestimmen die Wanderungsge-schwindigkeit der gelösten Teilchen.

14 Ionenaustauschchromatographie
Kationenaustausch- stationäre Phase Anion z.B. MonoS (-CH2SO3-) oder CM-Cellulose (-COO-) mobile Phase Kation Anionenaustausch- stationäre Phase Kation z.B. MonoQ (-CH2N+(CH3)3) oder DEAE-Sepharose (-CH2N+H(CH3)2) mobile Phase Anion

15 Gelfiltration oder Größenauschlußchromatographie

16 Affinitätschromatographie
Protein (mobile Phase) bindet mit hoher Affinität und Selektivität an immobilisierten Liganden (stationäre Phase) Elution erfolgt z.B. mit freiem Liganden (Kompetition)

17 Affinitätschromatographie
Affinitäts-tag Matrix Antigen Antikörper (immobiliert) 6His (His6-tag) Ni-NTA Strep-tag II (Peptid) Streptactin (Streptavidin-Derivat) Glutathion-S-Transferase Glutathion-Sepharose Calmodulin-Bindungs-Peptid Calmodulin-Affinitätsmatrix Maltose-Bindungs-Protein Amylose-Matrix

18 Glucose-Bindungsprotein
Glucose-Bindungsprotein bindet an immobilisierte Glucose Elution durch (freie) Glucose, die Glucose-Bindungsprotein von der Matrix ablöst (kompetitive Elution)

19 Ni-NTA-Affinitätschromatographie
Protein mit Histin-Affinitätstag bindet an immobilisierte Ni2+-Ionen Elution erfolgt durch Imidazol das mit dem Protein um die Bindung an Ni2+-Ionen konkurriert. Komplex aus His und Ni2+-NTA

20 Charakterisierung von Proteinen
Aktivitätsassay (z.B. enzymatische Aktivität) Elektrophorese (1-D/2-D) (IEP/Masse) Spektroskopische Methoden (Funktion/Struktur) Massenspektrometrie (Masse/Sequenz) Edman-Sequenzierung (Sequenz) Röntgenstrukturanalyse/NMR (Struktur)

21 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE)

22 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE)

23 Schematische Darstellung einer Protein-Aufreinigung analysiert mit Hilfe der SDS-PAGE

24 Isoelektrische Fokussierung/ 2-D Gelelektrophorese

25 2-D Gelelektrophorese

26 Western-Blotting

27 Western-Blotting Page 148 © 2004 John Wiley & Sons, Inc.
Voet Biochemistry 3e

28 ESI-MS Elektrospray-Ionisations-Massenspektrometrie

29 MALDI-TOF MS Matrix Assisted Laser Desorption Ionization - Time Of
Flight

30 Ionisierungsverfahren für Massenspektrometrie
Page 172 © 2004 John Wiley & Sons, Inc. Voet Biochemistry 3e

31 Massenspektrometrie exakte Bestimmung von Peptid/Proteinmassen

32 Identifizierung von Proteinen mit Hilfe der Massenspektrometrie
SDS-Gel oder 2D-Gel Bande/Spot ausschneiden Tryptischer Verdau der Proteine Bestimmung der Peptidmassen  Peptid-Fingerabdruck  Datenbanksuche nach Proteinen mit identischem Peptid-Fingerabdruck

33 Chemische Analyse von Proteinen

34 Protein-Sequenzierung Edman-Abbau

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36 Affinitätschromatographie/ Elektrophorese
Ziel des Versuchs Aufreinigung eines rekombinantes Proteins exprimiert in Escherichia coli über Affinitätschromatographie Verfolgung der Aufreinigung mittels Fluoreszenz Analyse der Aufreinigung mittels SDS-Gelelektrophorese Untersuchung zur Thermostabilität des Proteins aufgrund seiner Fluoreszenz im nativen Zustand

37 Grün-fluoreszierendes Protein (GFP)
Die biolumineszierende Qualle Aequorea victoria produziert Licht, wenn Energie des Ca2+-aktivierten Photoproteins Aequorin auf das Grün-fluoreszierende Protein (GFP) übertragen wird

38 GFP-Chromophor Chromophor entsteht nach oxidativer Zyklisierung des Tripeptids Ser-Tyr-Gly Der GFP-Chromophor fluoresziert nur, wenn es im nativ gefalteten Protein vorliegt

39 In vivo Fluoreszenz mittels GFP
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