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Der Western-Blot zum immunologischer Nachweis von Proteinen von Tim Grotjohann Veranstalter Lehrstuhl für Genetik Universität Bielefeld.

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Präsentation zum Thema: "Der Western-Blot zum immunologischer Nachweis von Proteinen von Tim Grotjohann Veranstalter Lehrstuhl für Genetik Universität Bielefeld."—  Präsentation transkript:

1 Der Western-Blot zum immunologischer Nachweis von Proteinen von Tim Grotjohann Veranstalter Lehrstuhl für Genetik Universität Bielefeld

2 Inhaltsübersicht: -Allgemeines zum Protein-Blot -Wichtiges zur Proteinaufreinigung und Gelelektrophorese -Blottingmembranen -Gel-Blot 1) Wet-Blot 2) Semi-Dry-Blot 3) Transferpuffer -Dot-Blot -Färbeverfahren für transferierte Proteine

3 Allgemeines zum Protein-Blot -Definition: beim Protein-Bloting werden Proteine auf eine Membran übertragen und dort einer spezifischen Nachweisreaktion unterzogen -DOT-Blot: Proteine werden direkt auf die Membran getüpfelt -Gel-Blot: Übertragung von Proteinen, die zuvor in einem Gel elektrophoretisch aufgetrennt wurden -die Membran: sie dient als Trägermatrix für die Proteine, auf der diese immobilisiert sind und sich somit leichter handhaben lassen -Western-/Immuno-Blotting: mittels einer spezifischen Antikörperreaktion lassen sich hiermit bestimmte Proteine identifizieren, die Molmassen dieser bestimmen oder auch die Spezifität eines Antikörpers bestimmen -es gibt noch weitere Verfahren, bei denen die Fähigkeit von Proteine ausgenutzt wird, an andere Moleküle zu binden (North-Western-Blotting, South-Western-Blotting, Virus-Overlay,…)

4 Wichtiges zur Proteinaufreinigung und Gelelektrophorese -Proteinaufreinigung: durch Degradierung von Proteinen können weitere Banden auf dem Gel entstehen – so kann es beim Kochen der Probe in SDS- und alkanolaminhaltigem Probenauftragspuffer zur Fragmentierung von Proteinen kommen deswegen wird eine Erhitzung auf lediglich 60°C für ca Minuten empfohlen -Gelelektrophorese: Je dünner das Gel, desto effizienter ist der Transfer – deshalb sollten Gele eine Dicke von 2mm möglichst nicht überschreiten

5 Blottingmembranen -Nylon: -hohe Proteinbindekapazität -besonders für das Blotten von sauren Proteinen oder bei Chemoluminiszenznachweisen -benötigt spezielle Blockingreagenzien (Casein und Polyvinylpyrrolidon) -Polyvinylidenfluorid (PVDF): -hohe Proteinbindekapazität (bis 600µg/cm²) -gute Resistenz gegen organische Lösungsmittel -gutes Signal/Hintergrund-Verhältnis bei Chemolumineszenz- Detektionssystemen

6 Blottingmembranen -Nitrocellulose (NC): -Bindekapazität von 180µg/cm² -kleine Porengröße von 0,025µm -günstiger als PVDF -beim Dot-Blot vorwiegend verwendet, da diese Membran eine hohe Saugfähigkeit hat

7 Gel-Blot -Der Transfer muss direkt nach der Auftrennung der Proteine erfolgen -Transfer-Methoden: -Diffusions- und Vakuumtransfer finden eher bei der Arbeit mit nativen Gelen ihre Verwendung -Als Standardverfahren hat sich der elektrophoretische Transfer durchgesetzt im Folgenden werden exemplarisch die elektrophoretischen VerfahrenWet-Blot uns Semi-Dry-Blot vorgestellt

8 Gel-Blot Wet-/Tank-BlotSemi-Dry-Blot -Vorteile des Semi-Dry-Blots sind die höhere Transfergeschwindigkeit und die sehr viel geringere Menge an verwendetem Transferpuffer -Der Wet-Blot hingegen ist schonender durch bessere Kühlmechanismen

9 Membran Gel + - Filterpapier Schwammtuch Kunstoffgitter 1) Wet-Blot Gel-Blot – 1)Wet-Blot

10 + - Membran 2) Semi-Dry-Blot 2kg Gel Filterpapier

11 3) Transferpuffer -grundsätzlich gibt es mehrere Alternativen -Er darf keine stark leitenden Salze enthalten, da diese zu hohen Strömen führen, was einen schlechten Transfer und eine Überhitzung der Apparatur zur Folge hat -der Puffer muss keinen exakten pH-Wert aufweisen (alle Werte zwischen 7,3 und 11 sind akzeptabel) -Er enthält 0- 20% Methanol, welches die Membran benetzt und so die Proteinbindung erleichtert, sowie die SDS-Bindungen lockert

12 Dot-Blot -Hierbei wird auf die gelelektrophoretische Trennung verzichtet und die Proteine direkt auf die Membran getüpfelt -Hauptanwendungsgebiete: -immunchemische Quantifizierung kleinster Proteinmengen -Detektion bestimmter Proteine aus einem Proteingemisch -Bestimmung von Nachweisgrenzen von Detektionssystemen -bei Verwendung von Proteinen mit sehr hoher/kleiner Molmasse, oder solchen, die durch die Elektrophorese beschädigt würden, oder durch ihre hohe Ionenstärke die Trennung stören würden -nur dann anwendbar, wenn monoklonale Antikörper oder Proben mit nur einem Protein verwendet werden

13 Färbeverfahren für transferierte Proteine Die Effizienz eines Blotvorgangs lässt sich mit unspezifischen Proteinfärbemethoden bestimmen: -Ponceau-S-Färbung: -geeignet für NC und PVDF -Nachweisgrenze bei 5-15ng Protein/mm² -kolloidales Gold: -geeignet für NC und PVDF -Nachweisgrenze bei 0,25-1ng Protein/mm² -benötigt abgesättigte Membran -neigt zu irreversiblen Bindungen

14 -Fluorophore: -geeignet für NC und PVDF -Nachweisgrenze bei 0,25-1ng Protein/mm² -benötigt aufwändige optische Ausrüstung -Direktblau 71: -geeignet für NC und PVDF -Nachweisgrenze bei 0,5-1,5ng Protein/mm² (NC) bzw. 1-3ng Protein/mm² (PVDF) -hohe Kontrast Färbeverfahren für transferierte Proteine

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