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1 Gelelektrophorese von Proteinen SDS-PAGE, IEF, 2D Christina Himmler.

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Präsentation zum Thema: "1 Gelelektrophorese von Proteinen SDS-PAGE, IEF, 2D Christina Himmler."—  Präsentation transkript:

1 1 Gelelektrophorese von Proteinen SDS-PAGE, IEF, 2D Christina Himmler

2 2 Gliederung Was ist Gelelektrophorese? SDS-PAGE IEF 2D Vor- und Nachteile der dargestellten Methoden

3 3 Was ist Gelelektrophorese? geladene Teile (Proteine) wandern je nach Größe und Ladung in einem elektrischen Gleichstrom-Feld Zonenelektrophorese Verwendung eines oder mehrerer Puffer oder pH-Gradient Apparatur bestehend aus Trenneinheit (Kapillare, horizontale oder vertikale Kammern), Stromversorgung ( V und mA) und Kühlvorrichtung

4 4 Was ist Gelelektrophorese? Gelelektrophorese kontinuierlichdiskontinuierlich 1 Puffer 2 Puffer Aufteilung in Sammel- und Trenngel

5 5 Herstellung von Gelen zur Elektrophorese Gele aus Polyacrylamid oder Agarose Poymerisation von Acrylamid mit Bisacrylamid

6 6 Herstellung von Gelen zur Elektrophorese Totalacrylamidkonzentration Porengröße abhängig von Totalacrylamidkonzentration T [%]=g Acrylamid +g Bis x100 / 100mL Vernetzungsgrad (crosslinking) und Vernetzungsgrad (crosslinking) C [%]=g Bis x100 / (g Acrylamid +g Bis) unter Luftabschluss polymerisieren Polymerisationseffekt abhängig von Temperatur, pH-Wert, T-Wert etc. Nachpolymerisation, daher einen Tag stehen lassen

7 7 Gelelektrophorese Vorteile: hohe Auflösung (ca kDa) Porengröße variabel chemisch inert und stabil durchsichtig, gut anzufärben leicht aufzubewahren Nachteile: Monomere des Acrylamids neurotoxisch und cancerogen Porengröße limitiert: nur bis 800 kDa basische Gele werden hydrolysiert, nur bedingt haltbar

8 8 SDS-PAGE Sodium(Natrium)dodecylsulfat- Polyacrylamidgel- Elektrophorese anionisches Detergenz, überdeckt Eigenladung von Proteinen durch Erhitzen mit SDS-Überschuss: Auflösen der Quartär- und Tertiärstruktur reduzierende Thiolverbindung (β- Mercaptoethanol oder DDT) spaltet Schwefelbücken zwischen Cysteinen auf einheitliche Stab- bzw. ellipsoide Form Verwendung von SDS-haltigem (0,1%), diskontinuierlichen Tris-HCl / Tris-Glycin- Puffersystem

9 9 Disk. SDS-PAGE Sodium(Natrium)dodecylsulfat- Polyacrylamidgel- Elektrophorese einheitlich negativ Ladung, daher gleiche Wanderungsgeschwindigkeit Clˉ als Leit-Ion, Glycin als Folge-Ion

10 10 Disk. SDS-PAGE Sodium(Natrium)dodecylsulfat- Polyacrylamidgel- Elektrophorese Auftrennung der Stapel im Trenngel nur nach Molekülgröße! Anfärben mit Coomassie- Brilliant-Blau oder Silbernitrat Kalibrierungskurve Bestimmung der Molekülmasse durch Vergleich mit Standardprotein

11 11 Disk. SDS-PAGE Sodium(Natrium)dodecylsulfat- Polyacrylamidgel- Elektrophorese Vorteile: auch hydrophobe und denaturierte Proteine können aufgetrennt werden schnelle Trennung Wanderung in eine Richtung Trennung nach 1 Parameter: Molekulargewicht Nachteile: irreversibles Denaturieren der Proteine nicht kompatibel mit nicht-ionischen Detergenzien

12 12 IEF – Isoelektrische Fokussierung Wanderung der Proteine durch Gel mit pH-Gradient bis zum pI Stagnation am pI Konzentrierungseffekt wirkt Diffusion entgegen

13 13 IEF – Isoelektrische Fokussierung Herstellung von immobilisierten pH- Gradienten: Immobiline (Acrylamidderivate) werden in Gelmatrix einpolymerisiert, binden kovalent an Polyacrylamidnetzwerk R: Carboxygruppe oder tertiäre Aminogruppe schwache Säuren oder schwache Basen kontinuierliches Verändern des Immobilinmischungsverhältnisses während des Gießens

14 14 IEF – Isoelektrische Fokussierung Vorteile von Agarosegel: schnelle Trennung über 800 kDa ungiftig Vorteile von Polyacrylamidgel: kaum Hintergrund- färbung

15 15 IEF – Isoelektrische Fokussierung Vorteile: Endpunktmethode sehr genaue Trennung; erfasst Unterschiede in einer geladenen AS mit SDS-PAGE kombinierbar pI einfach zu ermitteln Nachteile: zeitaufwendig aufwendiges Anfärben Proteine können aggregieren, wandern nicht in das Gel ein

16 16 2D-Gelelektrophorese zweidimensionale Gelelektrophorese in zwei Schritten zuerst Auftrennung mittels IEF, anschließend SDS-PAGE elektrisches Feld um 90° gedreht

17 17 2D-Gelelektrophorese Vorteile: gute Auftrennung nach zwei Parametern ( pI und Molekülmasse) hohe Auflösung für alle Proteine universell einsetzbar schnell durchzuführen Nachteile: schwierige Durchführung Proteinverlust von IEF zu SDS-PAGE

18 18 Das war's, danke schön!


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