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Transfektionsmethoden und Transfektionsoptimierung Nadja Züfle pädiatrische Onkologie und Hämatologie, CVK.

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Präsentation zum Thema: "Transfektionsmethoden und Transfektionsoptimierung Nadja Züfle pädiatrische Onkologie und Hämatologie, CVK."—  Präsentation transkript:

1 Transfektionsmethoden und Transfektionsoptimierung Nadja Züfle pädiatrische Onkologie und Hämatologie, CVK

2 Transfektionsmethoden Nadja Züfle pädiatrische Onkologie und Hämatologie, CVK

3 Transfektion Einbringen von Fremd-DNA in Zellen oder Bakterien Transiente Expression Vorübergehende Expression z. B: Verlust bei Zellteilung (Verdünnung) Definitionen

4 Transfektionmethoden Methoden: 1.Retroviraler Gentransfer (eigentliche Bezeichnung: Transduktion) 2.Lipofektion 3.Elektroporation 4.CaPO4-Transfektion 5.Andere (z.B. Mikroinjektion, Genegun)

5 Transfektionsmethoden Methoden: 1.Retroviraler Gentransfer dauerhafte Expression 2.Lipofektion transiente 3.Elektroporation Expression 4.CaPO4-Transfektion 5.Andere (z.B. Mikroinjektion, Genegun)

6 Retroviraler Gentransfer Retroviraler Lebenyzyklus: RNA-Strang Infektion & Enthüllung RNA DNA Reverse Transkription Integration

7 Retroviraler Gentransfer Retroviren und Gentransfer: Verpackungszell-Linie (alle Erbinformation für das leere Virus)

8 Retroviraler Gentransfer Retroviren und Gentransfer: Verpackungszell-Linie (alle Erbinformation für das leere Virus) Plasmid mit dem einzubringenden Gen (= Virusinhalt)

9 Retroviraler Gentransfer Retroviren und Gentransfer: Verpackungszell-Linie (alle Erbinformation für das leere Virus) Plasmid mit dem einzubringenden Gen (= Virusinhalt) Einbringen des Plasmids durch Transfektion

10 Retroviraler Gentransfer Retroviren und Gentransfer: Verpackungszell-Linie (alle Erbinformation für das leere Virus) Plasmid mit dem einzubringenden Gen (= Virusinhalt) Einbringen des Plasmids durch Transfektion Virusproduktion

11 Retroviraler Gentransfer Retroviren und Gentransfer: Infektion

12 Retroviraler Gentransfer Retroviren und Gentransfer: Infektion Reverse Transkription

13 Retroviraler Gentransfer Retroviren und Gentransfer: Infektion Integration Reverse Transkription

14 Lipofektion Prinzip der Lipofektion: DNA + liposomales Reagenz Inkubation Liposomen endozytotische Aufnahme Transient veränderte Zelle

15 Elektroporation Prinzip der Elektroporation: DNA Zellsuspension

16 Elektroporation Prinzip der Elektroporation: DNA Zellsuspension

17 Elektroporation Prinzip der Elektroporation: DNA Zellsuspension Küvette zwischen Elektroden positionieren

18 Elektroporation Prinzip der Elektroporation: DNA Zellsuspension Spannung und Kapazität einstellen

19 Elektroporation Prinzip der Elektroporation: DNA Zellsuspension Puls auslösen

20 Elektroporation Prinzip der Elektroporation: DNA Zellen Puls auslösen

21 Elektroporation Prinzip der Elektroporation: DNA Zellen Aufnahme der DNA

22 CaPO 4 -Transfektion Prinzip der CaPO 4 -Transfektion:

23 CaPO 4 -Transfektion Prinzip der CaPO 4 -Transfektion:

24 CaPO 4 -Transfektion Prinzip der CaPO 4 -Transfektion:

25 CaPO 4 -Transfektion Prinzip der CaPO 4 -Transfektion:

26 Transfektionsoptimierung am Beispiel der CaPO 4 -Transfektion Nadja Züfle pädiatrische Hämatologie und Onkologie, CVK

27 Optimierung 1.Ausgangsprotokoll Trono Laboratories, Genf

28 Optimierung 1.Ausgangsprotokoll Trono Laboratories, Genf 2.Welche Parameter sind wichtig? Zelldichte DNA-Menge CaPO 4 -Menge pH-Wert des Puffers Inkubationszeit andere (Temperatur der Reagenzien, Handhabung, Mengenverhältnisse, …)

29 Optimierung 3. Ansatztabelle Nr.Zell- dichte DNACaPO4pH Puffer Inkuba- tionszeit Transfektions- effizienz 13 * µg250 µl7,135 MinIm FACS auswerten 23 * µg250 µl7,135 Min 33 * µg250 µl7,135 Min

30 Optimierung 3. Ansatztabelle Nr.Zell- dichte DNACaPO4pH Puffer Inkuba- tionszeit Transfektions- effizienz 13 * µg250 µl7,135 MinIm FACS auswerten 23 * µg250 µl7,135 Min 33 * µg250 µl7,135 Min 4. Plasmid-DNA Zur Optimierung ein Plasmid mit Reportergen z.B. GFP gute Auswertbarkeit im FACS

31 Optimierung Protokoll – Tag 0Ausaat 24 h vor der Transfektion Zellen splitten und mit der gewünschten Zelldichte aussäen (z.B. 3*10 6 Zellen auf einer 10 cm Platte)

32 Optimierung Protokoll – Tag 1Transfektion Zutaten pro Ansatz je ein 10 ml Tube 250 µl steriles Wasser DNA (z.B. 40 µg für 3*10 6 Zellen) 500 µl HBS 250 µl 0,5 M CaCl 2 1 ml Plastikpipette Vortexer (so nah wie möglich an der Sterilbank oder sogar drunter) Alle Reagenzien: Raumtemperatur!

33 Optimierung Protokoll – Tag 1 Transfektion 250 µl steriles Wasser 250 µl CaCl2-Lösung Mischen durch Pipettieren DNA (z.B. 40 µg)

34 Optimierung Protokoll – Tag 1 Transfektion 250 µl steriles Wasser 250 µl CaCl2-Lösung Mischen durch Pipettieren DNA (z.B. 40 µg) Kräftig vortexen dabei 500 µl 2fach HBS- Lösung dazugeben 1 Tropfen pro Sekunde!

35 Optimierung Protokoll – Tag 1 Transfektion 250 µl steriles Wasser 250 µl CaCl2-Lösung Mischen durch Pipettieren Kräftig vortexen dabei 500 µl 2fach HBS- Lösung dazugeben 1 Tropfen pro Sekunde! dann 35 Min. inkubieren bei RT DNA (z.B. 40 µg)

36 Optimierung Protokoll – Tag 2 Detoxifikation 24 h nach Transfektion Mediumwechsel durchführen warmes Medium!

37 Optimierung Protokoll – Tag 2 Detoxifikation 24 h nach Transfektion Mediumwechsel durchführen warmes Medium! Protokoll – Tag 3 -Auswertung Auswertung der Zellen im FACS Anteil der lebenden Zellpopulation, die das GFP produziert? Anteil der überlebenden Zellen?


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