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Transfektionsmethoden und Transfektionsoptimierung
Nadja Züfle pädiatrische Onkologie und Hämatologie, CVK Transfektionsmethoden und Transfektionsoptimierung
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Transfektionsmethoden
Nadja Züfle pädiatrische Onkologie und Hämatologie, CVK Transfektionsmethoden
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Einbringen von Fremd-DNA in Zellen oder Bakterien
Definitionen Transfektion Einbringen von Fremd-DNA in Zellen oder Bakterien Transiente Expression Vorübergehende Expression z. B: Verlust bei Zellteilung („Verdünnung“)
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Transfektionmethoden
Retroviraler Gentransfer (eigentliche Bezeichnung: Transduktion) Lipofektion Elektroporation CaPO4-Transfektion Andere (z.B. Mikroinjektion, Genegun)
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Methoden: Retroviraler Gentransfer dauerhafte Expression
Transfektionsmethoden Methoden: Retroviraler Gentransfer dauerhafte Expression Lipofektion transiente Elektroporation Expression CaPO4-Transfektion Andere (z.B. Mikroinjektion, Genegun)
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Retroviraler Lebenyzyklus:
Retroviraler Gentransfer Retroviraler Lebenyzyklus: RNA-Strang Infektion & „Enthüllung“ RNA DNA Reverse Transkription Integration
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Retroviren und Gentransfer:
Retroviraler Gentransfer Retroviren und Gentransfer: Verpackungszell-Linie (alle Erbinformation für das „leere“ Virus)
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Retroviren und Gentransfer:
Retroviraler Gentransfer Retroviren und Gentransfer: Verpackungszell-Linie (alle Erbinformation für das „leere“ Virus) Plasmid mit dem einzubringenden Gen (= „Virusinhalt“)
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Retroviren und Gentransfer:
Retroviraler Gentransfer Retroviren und Gentransfer: Verpackungszell-Linie (alle Erbinformation für das „leere“ Virus) Plasmid mit dem einzubringenden Gen (= „Virusinhalt“) Einbringen des Plasmids durch Transfektion
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Retroviren und Gentransfer:
Retroviraler Gentransfer Retroviren und Gentransfer: Verpackungszell-Linie (alle Erbinformation für das „leere“ Virus) Plasmid mit dem einzubringenden Gen (= „Virusinhalt“) Einbringen des Plasmids durch Transfektion Virusproduktion
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Retroviren und Gentransfer:
Retroviraler Gentransfer Retroviren und Gentransfer: Infektion
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Retroviren und Gentransfer:
Retroviraler Gentransfer Retroviren und Gentransfer: Reverse Transkription Infektion
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Retroviren und Gentransfer:
Retroviraler Gentransfer Retroviren und Gentransfer: Reverse Transkription Infektion Integration
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Prinzip der Lipofektion:
DNA + liposomales Reagenz Inkubation Liposomen endozytotische Aufnahme Transient veränderte Zelle
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Prinzip der Elektroporation:
DNA Zellsuspension
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Prinzip der Elektroporation:
DNA Zellsuspension
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Prinzip der Elektroporation:
DNA Zellsuspension Küvette zwischen Elektroden positionieren
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Prinzip der Elektroporation:
DNA Zellsuspension Spannung und Kapazität einstellen
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Prinzip der Elektroporation:
DNA Zellsuspension Puls auslösen
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Prinzip der Elektroporation:
Zellen Puls auslösen DNA
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Prinzip der Elektroporation:
Zellen DNA Aufnahme der DNA
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Prinzip der CaPO4-Transfektion:
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Prinzip der CaPO4-Transfektion:
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Prinzip der CaPO4-Transfektion:
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Prinzip der CaPO4-Transfektion:
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Transfektionsoptimierung
Nadja Züfle pädiatrische Hämatologie und Onkologie, CVK Transfektionsoptimierung am Beispiel der CaPO4-Transfektion
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Ausgangsprotokoll Trono Laboratories, Genf
Optimierung Ausgangsprotokoll Trono Laboratories, Genf
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Ausgangsprotokoll Trono Laboratories, Genf
Optimierung Ausgangsprotokoll Trono Laboratories, Genf Welche Parameter sind wichtig? Zelldichte DNA-Menge CaPO4-Menge pH-Wert des Puffers Inkubationszeit andere (Temperatur der Reagenzien, Handhabung, Mengenverhältnisse, …)
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3. Ansatztabelle Optimierung Nr. Zell-dichte DNA CaPO4 pH Puffer
Inkuba-tionszeit Transfektions-effizienz 1 3 * 106 20 µg 250 µl 7,1 35 Min Im FACS auswerten 2 30 µg 3 40 µg
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3. Ansatztabelle 4. Plasmid-DNA
Optimierung 3. Ansatztabelle Nr. Zell-dichte DNA CaPO4 pH Puffer Inkuba-tionszeit Transfektions-effizienz 1 3 * 106 20 µg 250 µl 7,1 35 Min Im FACS auswerten 2 30 µg 3 40 µg 4. Plasmid-DNA Zur Optimierung ein Plasmid mit Reportergen z.B. GFP gute Auswertbarkeit im FACS
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Optimierung Protokoll – Tag 0 Ausaat 24 h vor der Transfektion Zellen splitten und mit der gewünschten Zelldichte aussäen (z.B. 3*106 Zellen auf einer 10 cm Platte)
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Protokoll – Tag 1 Transfektion
Optimierung Protokoll – Tag 1 Transfektion Zutaten pro Ansatz je ein 10 ml Tube 250 µl steriles Wasser DNA (z.B. 40 µg für 3*106 Zellen) 500 µl HBS 250 µl 0,5 M CaCl2 1 ml Plastikpipette Vortexer (so nah wie möglich an der Sterilbank oder sogar drunter) Alle Reagenzien: Raumtemperatur!
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Protokoll – Tag 1 Transfektion
Optimierung Protokoll – Tag 1 Transfektion 250 µl steriles Wasser 250 µl CaCl2-Lösung DNA (z.B. 40 µg) Mischen durch Pipettieren
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Protokoll – Tag 1 Transfektion
Optimierung Protokoll – Tag 1 Transfektion 250 µl steriles Wasser 250 µl CaCl2-Lösung DNA (z.B. 40 µg) Kräftig vortexen dabei 500 µl 2fach HBS-Lösung dazugeben 1 Tropfen pro Sekunde! Mischen durch Pipettieren
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Protokoll – Tag 1 Transfektion
Optimierung Protokoll – Tag 1 Transfektion 250 µl steriles Wasser 250 µl CaCl2-Lösung DNA (z.B. 40 µg) Kräftig vortexen dabei 500 µl 2fach HBS-Lösung dazugeben 1 Tropfen pro Sekunde! dann 35 Min. inkubieren bei RT Mischen durch Pipettieren
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Protokoll – Tag 2 Detoxifikation
Optimierung Protokoll – Tag 2 Detoxifikation 24 h nach Transfektion Mediumwechsel durchführen warmes Medium!
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Protokoll – Tag 2 Detoxifikation
Optimierung Protokoll – Tag 2 Detoxifikation 24 h nach Transfektion Mediumwechsel durchführen warmes Medium! Protokoll – Tag 3 - Auswertung Auswertung der Zellen im FACS Anteil der lebenden Zellpopulation, die das GFP produziert? Anteil der überlebenden Zellen?
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