Protein- bestimmung.

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1 Protein- bestimmung

2 Proteine Proteine gehören zu den wichtigsten Bestandteilen einer Zelle
Sie erfüllen vielfältigste Aufgaben → viele verschiedene Proteine notwendig Oft ist eine Aufreinigung nicht ganz einfach Trennen und Reinigen: Elektrophoretische Techniken: SDS-PAGE, Isoelektrische Fokussierung, D-Gelelektrophorese Chromatographische Techniken: Affinitätschromatographie, Ionenaustauschchromatographie, Hydrophobe Chromatographie Zu beachten: Löslichkeit in wässrigen Puffern Verfügbare Menge Säure/Base-Eigenschaften Biologische Aktivität Stabilität

3 Nachweisgrenzen [µg/ml]
Bestimmung Gesamtproteingehalt bestimmen → möglichst objektive Methode Konzentration eines bestimmten Proteins bestimmen → prinzipiell alle Methoden möglich Immer wichtig: Geeigneten Standard wählen ! Quantitative Bestimmung durch Färbetests: 0,05-0,5 Bradford-Assay 0,1-1 BCA-Assay Lowry nach Hartree 1-10 Biuret-Assay Nachweisgrenzen [µg/ml] Test

4 Biuret Reaktion in alkalischem, wässrigem Milieu:
Cu2+ + Peptidbindung = blauvioletter Komplex (objektiv) Cu2+ + Tyrosinreste = blauvioletter Komplex (subjektiv) toleriert SDS oder andere Detergenzien in geringen Mengen sehr unempfindlich, vor allem Ammonium, schwach reduzierenden und stark oxidierende Substanzen stören Cu2+-Protein-Komplex

5 Lowry Kombination der Biuret-Reaktion mit dem Folin-Ciocalteau-Phenol-Reagenz: Cu2+-Protein-Komplex (und auch Tyrosin-reste) + Folin-Ciocalteau-Phenol-Reagenz = Blaues Produkt sensitiver als Biuret Färbung ist zeitlich instabil, Test noch subjektiver als Biuret, l durch viele Substanzen beeinträchtigt: EDTA, Ammoniumsulfat, TritonX-100, SDS,...

6 BCA (Bicinchoninsäure) Assay
Kombination der Biuret-Reaktion mit Bicinchoninsäure schnell, beeinflussbare Sensitivität über die Temperatur, stabiler Komplex, TritonX-100 stört nicht hohe Störanfälligkeit: EDTA, Ammoniumsulfat, Glucose, ...

7 Bradford Absorptionsmaximum von Coomassie-Brilliantblau im sauren Milieu durch Proteine von 465nm zu 595nm verschoben Grund: Komplexbildung des Farbstoffs mit den kationischen und unpolaren, hydrophoben Seitenketten der Proteine, vor allem Arginin, weniger Lysin, Histidin, Tryptophan, Tyrosin und Phenylalanin empfindlichster und einfachster quantitativer Färbeassay, tolerant gegenüber Redoxmitteln größte Subjektivität, viele Proteine fallen aus, da Reaktion im Sauren abläuft Coomassie-Brilliantblau G250

8 Spektrometrie Unempfindlicher als kolorimetrische Methoden und benötigen höhere Proteinkonzentrationen, eher bei reineren Proteinlösungen geeignet Messung bei 280nm: bei Nukleinsäureanteil < 20% : Formel (1,55*A280)-(0,76*A260) = Proteinkonzentration [mg/ml] leicht, schnell, Proteinkonzentrationen zwischen 20 und 3000 µg/ml einsetzbar, geringe Störanfälligkeit vor allem an Tryptophan orientiert → subjektiv Messung bei 205nm: Formel (31*A205)/d = Proteinkonzentration [mg/ml] Absorption der Peptidbindung wird gemessen → objektiver einsetzbare Proteinkonzentration nur 1-100µg/ml, hohe Störanfälligkeit, da alle C=C- und C=O-Doppelbindungen stören

9 ENDE