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Isolierung und Aufreinigung von Nukleinsäuren Molekularbiologische Arbeitstechniken WS 04.

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Präsentation zum Thema: "Isolierung und Aufreinigung von Nukleinsäuren Molekularbiologische Arbeitstechniken WS 04."—  Präsentation transkript:

1 Isolierung und Aufreinigung von Nukleinsäuren Molekularbiologische Arbeitstechniken WS 04

2 Isolierung und Aufreinigung von Nukleinsäuren 1.Nukleinsäureextrakion: 1)Isolierung 2)Reinigung 3)Konzentrationsbestimmung 2.Nukleinsäureextrakion genomischer DNA 3.Nukleinsäureextrakion niedermolekularer DNA 4.Analyse: 1.Elektrophorese 2.Färbung 5.Zusammenfassung

3 1.Nukleinsäureextraktion Aufgereinigte Nukleinsäureextrakte Grundvoraussetzung der Nukleinsäureanalytik –Verunreinigungen: Nukleasen, Nukleinsäuren anderer Art, Salze, Makromoleküle Grundsätzliche Verfahrensschritte: 1.Isolierung 2.Reinigung 3.Konzentrationsbestimmung 4.Analyse Verfahren abhängig von Species, Nukleinsäuretypus und weiterer Anwendung

4 1.1. Isolierung Isolierung genomischer DNA: Isolierung niedermolekularer DNA: HerkunftEigenschaftenProbleme Gewebe Zellkulturen Organismen (z.B. Bakterien, Hefe) Hochmolekular (>200 kbp) Zerstückelung durch Scherkräfte Verpackung (Histone, u.a.) HerkunftEigenschaftenProbleme Bakterien-Plasmide Hefe-Plasmide virale DNA extrachromos. DNA Niedermolekular (2- 200kbp) oft zirkulär Verunreinigungen

5 1.1. Isolierung 1.Aufschluss mit Detergenzien, z.B. SDS durch Enzyme, z.B. Lysozym bei Bakterien Mechanischer Aufschluß Kochen 2.Proteindenaturierung Proteinase K (Protease) chemisch: Phenolisierung, SDS, NaOH

6 1.2. Reinigung Phenolextraktion: Ausschütteln mit Wasser - Phenol: Phenol denaturiert Proteine, nach Zentrifugation: wässrige Nukleinsäurelösung – Proteine in Interphase oder Phenolphase Ausschütteln mit Wasser - Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol: stabilere Phasengrenze, gründlichere Denaturierung Phenolisierung wiederholen, bis Interphase sich nicht mehr bildet

7 Phenolextraktion:

8 1.2. Reinigung Gelfiltration Molekularsiebeffekt: große DNA-Moleküle dringen nicht in Gelporen ein – eluieren schneller als niedermolekulare DNA Fraktionierte Sammlung des Eluats

9 1.2. Reinigung Ethanolpräzipitation: Ausfällung der Nukleinsäure mit Ethanol + monovalente Kationen Konzentrierungseffekt, waschen mit 70% Ethanol

10 1.3. Konzentrationsbestimmung Photometrische Konzentrationsbestimmung: Adsorptionsmaximum doppelsträngiger DNA bei 260 nm durch aromatische Ringe der Basen 50μg/ml doppelsträngige DNA hat Adsorptionswert von 1 (Vorraussetzung: 1cm Schichtdicke, Quarzküvette) Hyperchromie: einzelsträngige Nukleinsäuremoleküle besitzen höhere Adsorption (1 OD 260 entspricht 33 μg/ml RNA bzw. 40 μg/ml einzelsträngiger DNA) Konzentrationsbestimmung kurzer Oligonukleotide über Summe der Adsorptionskoeffizienten der einzelnen Basen Bestimmung der Reinheit: Messung OD 260 /OD 280 -Wert (1,8 = rein)

11 1.3. Konzentrationsbestimmung Ethidiumbromidanfärbung: bei geringen Nukleinsäuremengen: Bestimmung der Konzentration durch Ethidiumbromidanfärbung – Vergleich mit Verdünnungsreihe planare Struktur - interkaliert in die Nukleinsäure durch Interaktion der aromatischen/heteroaromatischen Ringe

12 2.1 Isolierung genomischer DNA 1.Zellwandaufschluss und Proteinabbau OrganismusAufschlussProteinabbau Eukaryotische Zellkulturen Natriumdodecylsulfat (SDS) Proteinase K GewebeSDS / Proteinase KProteinase K Pflanzen SDS oder N-Laurylsarkosin Proteinase K Hefe Zymolase oder Lyticase Proteinase K BakterienLysozymProteinase K Proteinase K: Serinprotease, schneidet relativ unspezifisch, nicht hemmbar durch Ionen/EDTA, benötigt SDS

13 Molekülgrößen um 80 kbp: –Aufschluss und Proteindenaturierung durch Guanidium- Hydrochlorid –DNA-Isolation durch Ethanolfällung Anwendung: Southern-Blot, PCR Molekülgrößen kbp: –Phenolextraktion –DNA an Phasengrenze Wasser-Phenol –DNA-Entnahme durch Aufrollen auf steriles Stäbchen Anwendung: Southern-Blot, Genombanken mit Phage λ Molekülgröße > 200 kbp: –Denaturierung von Proteinase K und Protein-DNA-Komplexen durch Formamid –Dialyse in Collodion-Schläuchen minimale Scherkräfte Anwendung: Cosmidbanken 2.2: Reinigung genomischer DNA

14 3.1: Isolierung niedermolekularer DNA 1.Anzucht : Mini- ( 100ml Bakterienkultur) Steigerung der Plasmidausbeute durch selektive Amplifikation (Translationsinhibitoren) 2.Aufschluss: AufschlussartLyse durch:Hintergrund alkalische Lyse SDS/NaOHschnell, low copy Kochlyse Lysozym/100°C Lithium-MethodeLiCl/Triton X-100<10 kbp SDS-LyseLysozym/SDS>15 kbp

15 3.1: Isolierung niedermolekularer DNA 1.alkalische Lyse: EDTA, RNase, 95°C, SDS-Lyse, NaOH-denaturiert DNA Plasmid-Renaturierung durch Kaliumdodecylsulfat Abzentrifugation unlöslicher Komponenten Fällung mit Ethanol oder Isopropanol – waschen schnelle Methode – zum Austesten von Klonierungen 2.Kochlyse: Lysozym, aufkochen, abzentrifugieren denaturierter Bestandteile DNA in Lösung, gegebenenfalls Phenolisierung der DNA gegen Endonuclease – Präzipitation

16 3.1: Isolierung niedermolekularer DNA 3.Lithium-Methode: Triton 100X (Detergenz)/LiCl – Auflösung der Plasmamembran Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol denaturiert Proteine/Membranen Plasmid-DNA bleibt gelöst 4.SDS-Lyse: Lyse durch SDS, partielle Fällung chromosomaler DNA durch NaCl nach Zentrifugation – Plasmide im Überstand geeignet für große Plasmide

17 3.2. Reinigung niedermolekularer DNA negativ geladene DNA bindet an positiv geladenes Säulenmaterial (z.B. DEAE) degradierte Proteine/RNA binden nicht Auswaschen der DNA mit hohen Salzkonzentrationen 1. Reinigung über Anionenaustauschersäulen:

18 3.2. Reinigung niedermolekularer DNA 2.Dichtegradientenzentrifugation: Zentrifugation in CsCl-Gradient + Ethidiumbromid liefert hochreine DNA Ethidiumbromid interkaliert stärker in lineare als zirkuläre DNA Dichteunterschiede (Proteine: geringere Dichte, RNA pelletiert) Auswaschung: Ethidiumbromid mit n-Butanol, CsCl durch Dialyse

19 4.Analyse Wie groß sind extrahierte Nukleinsäuren? In welcher Konformation liegt Nukleinsäure vor? Sind eventuell transformierte Elemente eingebaut worden? Analyseverfahren: 1.Auftrennung durch Gelelektrophorese 2.Anfärbung

20 4.1: Analyse - Gelelektrophorese Trägermaterial: Agarose oder Polyacrylamid Nukleinsäuren negativ geladen (Phosphatgruppen) Verhältnis Ladung : Molekulargewicht ist konstant Trennung im Gel nach Molekülgrößen Ogston-Siebeffekt (globuläre DNA)/ Reptationstheorie (lineare DNA)

21 4.1: Analyse - Gelelektrophorese Auftrennung in Agarosegelen: Wanderungsgeschw. abh. von Agarosekonz., Spannung, Laufpuffer, interkalierenden Farbstoffen denaturierende Bedingungen um Sekundärstrukturbildung zu verhinden Trennung linearer, doppelsträngiger DNA: lineare Abh. von log Länge (bp) zu Wanderungsdistanz Trennung zirkulärer DNA: superhelical > linear > relaxiert (Abb)

22 4.2: Analyse - Anfärbung Ethidiumbromid: Anregung unter UV-Licht, Nachweisgrenze: ng ändert Konformation zirkulärer DNA-Moleküle SYBR Green/TOTO1/YOYO1: Fluoreszenzfarbstoffe – sensitiver (binden mit höherer Affinität) und weniger mutagen als Ethidiumbromid Silberfärbung: extrem sensitiv: Nachweisgrenze 0,03 ng/mm², nicht mutagen - Reduktion von Silbernitrat zu reinem Silber Nachteil: zeitaufwendig, hohe Hintergrundfärbung

23 5.Zusammenfassung Nukleinsäureextraktion: 1.Isolierung 2.Reinigung 3.Konzentrationsbestimmung 4.Analyse Verfahren abhängig von Größe und Art der Nukleinsäure, Ausgangsorganismus und Verwendungszweck

24 The End!!


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