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Computerkurs: Quantitative Auswertung biochemischer Experimente Guten Morgen.

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Präsentation zum Thema: "Computerkurs: Quantitative Auswertung biochemischer Experimente Guten Morgen."—  Präsentation transkript:

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2 Computerkurs: Quantitative Auswertung biochemischer Experimente Guten Morgen

3 Computerkurs: Quantitative Auswertung biochemischer Experimente Computerkurs: Quantitative Auswertung biochemischer Experimente: Tag 2 Auswertung von Michaelis-Menten Kinetiken Aufgabe 4: Michaelis-Menten Kinetiken I Einführung in die Auswertung von Dissoziationskinetiken Aufgabe 5: Auswertung von Dissoziationskinetiken

4 Computerkurs: Quantitative Auswertung biochemischer Experimente Schnell !

5 Computerkurs: Quantitative Auswertung biochemischer Experimente Anpassung Wähle Modell Definiere Parameter Berechne theoretische Daten (mit willkürlichen Startwerten für alle Parametern). Berechne Abweichung zwischen den theoretischen Daten und den gemessenen Daten: Minimiere FQS durch Variation der Parameter. Ergebnis Kombination an Zahlenwerten für alle Parameter, welche die gemessenen Daten am besten beschreibt

6 Computerkurs: Quantitative Auswertung biochemischer Experimente Warum Fehlerquadrate? (d.h. die Häufigkeit von Abweichungen sinkt mit dem Quadrat der Abweichung) Große Abweichungen werden stärker gewichtet gerechtfertigt bei normalverteilten Daten Dann gilt

7 Computerkurs: Quantitative Auswertung biochemischer Experimente 1. Parameter 2. Parameter Minimum der FQS Suche nach Minimum der FQS im N-dimensionalen Fehlerraum

8 Computerkurs: Quantitative Auswertung biochemischer Experimente Wie funktioniert nicht-lineare Regression? Programm berechnet die Steigung der Fehlerfläche, bei den Startbedingungen. Variablen werden einen Schritt in Richtung des Minimums verändert. Programm berechnet am Zielpunkt erneut die Steigung der Fehlerfläche und verändert die Variablen erneut. u.s.w. Kritische Parameter Schrittweite Intensität des Absuchens der Fehlerfläche

9 Computerkurs: Quantitative Auswertung biochemischer Experimente Suche nach Minimum der FQS im N- dimensionalen Fehlerraum. 1. Parameter 2. Parameter Minimum der FQS mögliche Komplikation: Nebenminima mögliche Komplikation: schlechte Startwerte Anpassungen (besonders komplexe) sollten mit verschiedenen Startwerten mehrmals durchgeführt werden

10 Computerkurs: Quantitative Auswertung biochemischer Experimente Anforderungen an Auswertungsmethoden optische Kontrolle (alle Auswertung müssen mit Grafiken auf ihren Sinngehalt und ihre Genauigkeit hin überprüft werden) kein Datenverlust (es dürfen bei Manipulationen niemals die Originaldaten verloren gehen) keine unübersichtliche Fehlerfortpflanzung (möglichst keine Anwendung von 1/x, yx o.ä. auf die Daten)

11 Computerkurs: Quantitative Auswertung biochemischer Experimente Auswertung von Michaelis-Menten Kinetiken veraltete Auswertung: Linearisierung (z.B. Lineweaver-Burk) y = a+bx Funktion

12 Computerkurs: Quantitative Auswertung biochemischer Experimente Probleme bei der Linearisierung von Daten Lineare Regression setzt voraus, daß alle Datenpunkte dieselbe Standardabweichung haben. Dies gilt nach Datentransformationen nicht mehr. Dieser Punkt ist am ungenauesten, beeinflusst das Ergebnis der linearen Regression aber sehr stark. 0 0,2 0,4 0,6 0, c S k /c S 1/k Fehler in direkter AuftragungFehler in LB-Auftragung

13 Computerkurs: Quantitative Auswertung biochemischer Experimente Wähle Modell: Parameter: Berechne theoretische Daten Berechne Abweichung zwischen den theoretischen Daten und den gemessenen Daten: Minimiere FQS durch Variation der Parameter. Ergebnis: die Kombination an Zahlenwerten für K m und k cat, welche die gemessenen Daten am besten beschreibt. Nicht-lineare Anpassung Michaelis-Menten Kinetik K m, k cat

14 Computerkurs: Quantitative Auswertung biochemischer Experimente Auswertung von Michaelis-Menten Kinetiken keine Datentransformation keine Verfälschung der Fehlerbereiche Genauigkeit der Messung und Auswertung direkt ablesbar

15 Computerkurs: Quantitative Auswertung biochemischer Experimente Behandlung von Ausreißern

16 Computerkurs: Quantitative Auswertung biochemischer Experimente Identifizierung von Ausreißern Ausreißer sind einzelne Werte, die nicht zu den anderen gemessenen Daten passen Wurde der Wert korrekt eingegeben? Werte, bei denen man eine Idee hat, was experimentell falsch gelaufen ist Gibt es andere Gründe (biologische Diversität)?

17 Computerkurs: Quantitative Auswertung biochemischer Experimente Behandlung von Ausreißern Zufall – Messwerte haben ein Verteilung Der Ausreißer muss mit berücksichtigt werden Fehler – Pipettierfehler etc. Der Ausreißer darf nicht berücksichtig werden Wie unterscheide ich zwischen beiden Fällen? Statistik (benötige aber viele Daten !)

18 Computerkurs: Quantitative Auswertung biochemischer Experimente Behandlung von Ausreißern Beispiele Die Natur macht keine Sprünge. Modell falsch ! aber:

19 Computerkurs: Quantitative Auswertung biochemischer Experimente Behandlung von Ausreißern Beispiele Mit LR darf nur Anfangsphase der Reaktion ausgewertet werden aber: Verbesserte Methode kann evtl. ganze Kurve beschreiben

20 Computerkurs: Quantitative Auswertung biochemischer Experimente Behandlung von Ausreißern Alle Daten wurden einer Gaussverteilung mit Mittelwert 100 und einer Standardabweichung von 100 entnommen Ausreißer ??? Vorsicht, wenn Messpunkte offensichtlich wie Ausreißer aussehen! Aus :http://www.graphpad.com/manuals/Prism4/RegressionBook.pdf

21 Computerkurs: Quantitative Auswertung biochemischer Experimente Einführung in die Fehleranalytik Sinnvolle Fehlerabschätzungen gehören zu den schwierigeren Aufgaben im wissenschaftlichen Alltagsbetrieb. Typische Fragestellungen sind: Wie zuverlässig sind meine Daten? Wie genau sind die berechneten Konstanten? Kann ich bestimmte Modelle ausschließen?

22 Computerkurs: Quantitative Auswertung biochemischer Experimente Messung A Messung B 15,4 16,0 B ist größer als A Mittelwert µ Standardabw. 5,2 3,4

23 Computerkurs: Quantitative Auswertung biochemischer Experimente Analyse der Genauigkeit einzelner Messungen Jacknife-Test Einzelne Punkte werden zufällig aus der Anpassung herausgenommen. Damit simuliert man, was man auswerten würde, wenn man diese Experimente nicht gemacht hätte. Man erhält, wenn man genug Daten hat, eine Verteilung von Parametern mit Mittelwert und Standardabweichung Eine solche Analyse sollte ein Routinebestandteil jeder Auswertung jedes Experimentes sein. Gute Methode, um Unsicherheit der Datenanalyse aufzudecken. Experimentelle Fehler werden nicht erfasst!

24 Computerkurs: Quantitative Auswertung biochemischer Experimente Auswertung von Dissoziationskinetiken AB A +B

25 Computerkurs: Quantitative Auswertung biochemischer Experimente Auswertung von Dissoziationskinetiken Modell: Lösung:

26 Computerkurs: Quantitative Auswertung biochemischer Experimente Auswertung von Michaelis-Menten Kinetiken Aufgabe 4: Michaelis-Menten Kinetiken I Einführung in die Auswertung von Dissoziationskinetiken Aufgabe 5: Auswertung von Dissoziationskinetiken


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