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Computerkurs: Quantitative Auswertung biochemischer Experimente Guten Morgen.

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Präsentation zum Thema: "Computerkurs: Quantitative Auswertung biochemischer Experimente Guten Morgen."—  Präsentation transkript:

1 Computerkurs: Quantitative Auswertung biochemischer Experimente Guten Morgen

2 Computerkurs: Quantitative Auswertung biochemischer Experimente Informationen Internet:

3 Computerkurs: Quantitative Auswertung biochemischer Experimente Ziele des Kurses Methodenerarbeitung, um typische biochemische Experimente (z.B. Thermodynamik und Kinetik von Makromolekül/Ligand Wechselwirkungen, Enzymkinetiken) quantitativ auswerten zu können. Verständnis für quantitative Auswertemethoden Fähigkeit zum selbständigen Lösen von speziellen Probleme Grundlagen der Thermodynamik und Kinetik für biochemische Anwendungen werden wiederholt.

4 Computerkurs: Quantitative Auswertung biochemischer Experimente Typischer Ablauf im Leben eines Wissenschaftlers Experiment Daten ???

5 Computerkurs: Quantitative Auswertung biochemischer Experimente Struktur des Kurses Vorstellung der Tagesaufgaben (Theorie, Vorgehensweise). Praktische Demonstration der Lösung der Aufgaben (Teilnahme optional). Nachbesprechung der Aufgaben des Vortages (Teilnahme optional). Eigenständiges Lösen der Aufgaben durch die Kursteilnehmer.

6 Computerkurs: Quantitative Auswertung biochemischer Experimente Protokoll für jede Aufgabe Fragestellung Kopie des programmierten Excel Arbeitsblatts. Vorstellung der Tagesaufgaben (Theorie, Vorgehensweise) Grafik Lösung der Aufgabe Achtung: In der Regel werden Ergebnisse mit Fehlerabschätzungen verlangt (185±13 Umsätze/min)

7 Computerkurs: Quantitative Auswertung biochemischer Experimente Programm Tag 1 Prinzipien der quantitativen Auswertung von Meßergebnissen Einführung in MS-Excel Aufgabe 1: Einführung in die Anwendung von MS-Excel Lineare Regression Aufgabe 2: Lineare Regression Aufgabe 3: Test des Solvermoduls Überprüfen der Installation von MS-Office

8 Computerkurs: Quantitative Auswertung biochemischer Experimente Alternative Computerprogramme II Kommerzielle erhältliche Programme SigmaPlot GraphPad Prism Kaleidagraph Scientist … Gut und teuer Enthalten oft vorgefertigte Modelle Gute graphische Darstellung

9 Computerkurs: Quantitative Auswertung biochemischer Experimente Alternative Computerprogramme II Alternative Programme (Freeware) Excel Add-Ins Gepasi Gepasi is a software system for the simulation of chemical and biochemical kinetics Dynafit Kuzmic, P. (1996) "Program DYNAFIT for the analysis of enzyme kinetic data: Application to HIV proteinase." Anal. Biochem. 237, Und viele andere …

10 Computerkurs: Quantitative Auswertung biochemischer Experimente Prinzipien der quantativen Auswertung von Experimenten Simulation des Experiments Modell Physikalische Konstanten mathematisch e Beziehung theoretische Daten Effektfaktoren Vergleich Experiment Systematische Variation der Parameter und Effektfaktoren experimentelle Daten

11 Computerkurs: Quantitative Auswertung biochemischer Experimente Prinzipien der quantativen Auswertung von Experimenten experimentelle Daten theoretische Daten Simulation des Experiments Physikalische Konstanten Modell Effektfaktoren mathematisch e Beziehung Vergleich Experiment Systematische Variation der Parameter und Effektfaktoren Bindung von A an B thermodynamisches Gleichgewicht c AB =f(K Ass, c B ) Konzentration von AB in Abhängigkeit von c B Gel-Shift Experiment K Ass

12 Computerkurs: Quantitative Auswertung biochemischer Experimente Definitionen Die Testlösung setzt sich aus unterschiedlichen Komponenten und Spezies zusammen. Komponenten sind Moleküle, die sich kovalent unterscheiden, z.B. Enzym, Substrat, Produkt. können untereinander Komplexe ausbilden, z.B. Enzym-Substrat. Spezies sind alle Lösungsbestandteile, die sich kovalent oder nicht-kovalent unterscheiden.

13 Computerkurs: Quantitative Auswertung biochemischer Experimente Definitionen Modell Das Modell definiert Vorstellung, was passiert/passieren könnte. Aus dem Modell folgt mathematische Beziehung zwischen Meßergebnis (z. B. cAB, cProdukt) und unabhängiger Variable (der Variable, die verändert wird, z.B. cA, t) Parameter Das Modell liefert bestimmte Parameter für die Anpassung, z.B. physikalische Konstanten, die wir als global bezeichnen werden. Mit Hilfe des Modells und (zunächst beliebigen) Anfangswerten für alle Parameter werden theoretische Konzentrationen aller interessierender Spezies berechnet.

14 Computerkurs: Quantitative Auswertung biochemischer Experimente Definitionen Effektfaktoren definieren die Beziehung zwischen der Messgröße (z.B. CPM, OD, Fluoreszenz) und der zu messenden Konzentration. sind weitere Parameter der Anpassung, die als Hilfsvariablen lokal sind. Mit Hilfe von Anfangswerten für die Effektfaktoren werden aus den theoretischen Konzentrationen theoretische Daten berechnet.

15 Computerkurs: Quantitative Auswertung biochemischer Experimente Anpassung Durch Variation der Zahlenwerte der Parameter und Effektfaktoren werden die theoretischen Daten möglichst gut an die experimentellen Daten angepasst. Die Kombination der Parameter, die die Daten am besten beschreiben kann, ist das Ergebnis der Messung.

16 Computerkurs: Quantitative Auswertung biochemischer Experimente Anforderungen an Auswertungsmethoden optische Kontrolle (alle Auswertung müssen mit Grafiken auf ihren Sinngehalt und ihre Genauigkeit hin überprüft werden) kein Datenverlust (es dürfen bei Manipulationen niemals die Originaldaten verloren gehen) keine unübersichtliche Fehlerfortpflanzung (möglichst keine Anwendung von 1/x, yx o.ä. auf die Daten)

17 Computerkurs: Quantitative Auswertung biochemischer Experimente Fragestellungen der Auswertung Mit welchen Zahlenwerten der Parameter lassen sich die Daten am besten beschreiben? Wie genau sind diese Zahlenwerte definiert (Fehlerabschätzung)? Beschreibt das Modell die Daten (im Rahmen der Messgenauigkeit)?

18 Computerkurs: Quantitative Auswertung biochemischer Experimente Modelle Das Modell definiert die Beziehungen zwischen den Meßgrößen und den Variablen des Experiments, z.B. der Konzentration eines Komplexes AB in Abhängigkeit von der Zeit, sowie der Konzentrationen von A und B: cAB = f(t, cA, cB) Somit erlaubt ein Modell die Berechnung von theoretischen Daten. Dabei gibt es zwei Arten von Lösungswegen: analytische und numerische.

19 Computerkurs: Quantitative Auswertung biochemischer Experimente Modelle Bei analytischen Lösungen ist die Beziehung zwischen Messgröße und Variable hinreichend einfach um mit Hilfe bekannter Größen (z.B. der eingesetzten Konzentrationen und der Zeit) das theoretische Signal zu berechnen, z.B. cAB bei Kenntnis von t, cA,ges und cB,ges. In manchen Fällen sind diese Beziehungen jedoch so komplex, dass eine analytische Lösung (für uns oder prinzipiell) nicht möglich ist. In solchen Fällen kann man sich theoretische Daten simulieren, z.B. durch eine numerische Integration.

20 Computerkurs: Quantitative Auswertung biochemischer Experimente Modelle Arbeitshypothese, die angezweifelt werden muss, wenn keine gute Anpassung der Daten möglich ist. Will man ein Modell durch ein komplizierteres ersetzen, ist genau zu überprüfen, ob die Daten dies rechtfertigen. Achtung: Komplizierte Modelle haben in der Regel mehr Variablen und mehr Variablen erlauben immer eine bessere Anpassung von Daten. Prinzip der Parsimonie: Man sollte versuchen Daten mit der minimal erforderlichen Anzahl an Variablen zu beschreiben.

21 Computerkurs: Quantitative Auswertung biochemischer Experimente Parameter Abhängig vom Modell erhält man eine Reihe von Parametern, die die Beziehung zwischen den gemessenen Daten und den Vorgaben des Modells herstellen. Man unterscheidet zwei Arten von Parametern: globale lokale

22 Computerkurs: Quantitative Auswertung biochemischer Experimente Parameter Globale Parameter sind in allen Datensätzen (die zusammengehören) gleich. sind oft physikalischen Größen, deren Zahlenwerte man messen möchte, z.B. Bindungskonstanten, kinetische Konstanten, etc. Lokale Parameter z.B. Effektfaktoren können von Experiment zu Experiment variieren (z.B. wie viel CPM produziert ein 1 µM Produkt) numerischen Werte dieser lokalen Parameter sind häufig uninteressant, gehen aber in die Ergebnisse der Auswertung ein.

23 Computerkurs: Quantitative Auswertung biochemischer Experimente Parameter Die Unterscheidung in lokale und globale Parameter ist dann wichtig, wenn man mehrere Datensätze zu einer Messung gemeinsam auswerten muss: die Zahlenwerte von globalen Parametern müssen in allen Fällen gleich sein, die von lokalen dürfen von Datensatz zu Datensatz variieren.

24 Computerkurs: Quantitative Auswertung biochemischer Experimente Anpassung Wähle Modell. Berechne theoretische Daten (mit willkürlichen Startwerten für alle Parametern). Berechne Abweichung zwischen den theoretischen Daten und den gemessenen Daten: FQS = Si(Si,exp - Si,theo)² Minimiere FQS durch Variation der Parameter. Ergebnis: die Kombination an Zahlenwerten für alle Parameter, welche die gemessenen Daten am besten beschreibt.

25 Computerkurs: Quantitative Auswertung biochemischer Experimente Tag 1 Prinzipien der quantitativen Auswertung von Meßergebnissen Einführung in MS-Excel Aufgabe 1: Einführung in die Anwendung von MS- Excel Lineare Regression Aufgabe 2: Lineare Regression Aufgabe 3: Test des Solvermoduls Überprüfen der Installation von MS-Office

26 Computerkurs: Quantitative Auswertung biochemischer Experimente Anforderungen an Auswertungsmethoden optische Kontrolle (alle Auswertung müssen mit Grafiken auf ihren Sinngehalt und ihre Genauigkeit hin überprüft werden) kein Datenverlust (es dürfen bei Manipulationen niemals die Originaldaten verloren gehen) keine unübersichtliche Fehlerfortpflanzung (möglichst keine Anwendung von 1/x, yx o.ä. auf die Daten)

27 Computerkurs: Quantitative Auswertung biochemischer Experimente Lineare Regression

28 Computerkurs: Quantitative Auswertung biochemischer Experimente Lineare Regression klassisches (und lange Zeit einziges) Verfahren zur Regressionsanalyse mehrerer Datenpunkte y = a + b x Achsenabschnitt:a = - b Steigung:

29 Computerkurs: Quantitative Auswertung biochemischer Experimente Typische Anwendung der linearen Regression Eichgerade zur Bestimmung von Konzentrationen Apparente Molekulargewichte, Stoke-Radiien etc. Massen (z.B. im MALDI TOF MS) Bestimmung der Anfangssteigung bei Enzymkinetiken

30 Computerkurs: Quantitative Auswertung biochemischer Experimente Lineare Regression in Excel


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