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5. Anreicherung und Isolierung Direktisolierung: –meist auf festen Nährböden –Verdünnung einer Probe und Ausbringen verschiedener Verdünnungsstufen –Beispiel:

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1 5. Anreicherung und Isolierung Direktisolierung: –meist auf festen Nährböden –Verdünnung einer Probe und Ausbringen verschiedener Verdünnungsstufen –Beispiel: fluoreszierende Pseudomonaden auf Nährboden verschiedene Verdünnungsstufen ausbringen bei entsprechender Temperatur (ca. 30°C) inkubieren Auswertung: bei Anregung mit UV 366 nm fluoreszieren Pseudomonaden Kolonien gelb-grün bis bläulich

2 5. Anreicherung und Isolierung Gewinnung von Reinkulturen: –Ausplattieren: vor allem für aerobe Kulturtechniken Herstellen einer Verdünnungsreihe in physiologischer (0,9% (w/v)) NaCl Lsg. meist in 10er oder 100er Schritten

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4 5. Anreicherung und Isolierung Gewinnung von Reinkulturen: –Ausplattieren: Herstellen von Agarplatten von der Verdünnungsreihe wird ein entsprechendes Inokulum (meist 0,1 oder 0,05 ml) auf dem Agar ausgebracht und mittels Drigalski-Spartel verteilt Inkubation bei entsprechender Temp. auf den Agarplatten wachsen, wenn der Abstand der Kulturen groß genug ist (Verdünnungsstufe (!)) einzelne Kolonien (cfu)

5 5. Anreicherung und Isolierung

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9 Gewinnung von Reinkulturen: –Vereinzeln: Mittels Impföse wird eine Kultur (cfu) von der Platte genommen und auf eine neue, sterile Agarplatte überimpft Flächenausstrich, Drei-Ösen-Ausstrich

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13 5. Anreicherung und Isolierung Gewinnung von Reinkulturen: Drei-Ösen-Ausstrich: –Agarplatte wird inkubiert und auf Wachstum kontrolliert markoskopisch: »Habitus: glattes oder ausgefranstes Wachstum »Schleimbildung mikroskopisch: »Form der Zellen: Stäbchen, Kokken, Mischformen »Gram-Färbung: g +, g - »um von einer Reinkultur ausgehen zu können, muss ein sehr hoher Grad morphologischer Ähnlichkeit deutlich zu erkennen sein »Endosporen

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15 5. Anreicherung und Isolierung Gewinnung von Reinkulturen: Drei-Ösen-Ausstrich: »wenn von einer Reinkultur ausgegangen werden kann, wird wiederum auf eine neue Agarplatte überimpft – dichter Ausstrich – oder es kann in ein Flüssigmedium überimpft werden (schnelleres Wachstum) »wenn die Kultur nicht rein ist, kann erneut ein Drei- Ösen-Ausstrich durchgeführt werden, solange, bis die Kultur vereinzelt werden konnte (Ausnahme: synthroph wachsende MO)

16 5. Anreicherung und Isolierung Gewinnung von Reinkulturen: –bei Anaerobieren: es kann nur schwer auf Platten gearbeitet werden (Sauerstoff!!!) – Alternative: Glove-Box

17 5. Anreicherung und Isolierung

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19 Gewinnung von Reinkulturen: –bei Anaerobieren: Schüttelagarkultur: –bei strikten Anaerobiern ev. mit Schwierigkeiten behaftet, zumindest nicht sehr einfach –für nicht extreme Anaerobier gut anwendbar –Arbeitsweise: »Anlegen einer Verdünnungsreihe, aber unter anoxischen Bedingungen (unter Sauerstoffabschluss arbeiten, Wasser abkochen, Reduktionsmittel, …) »Verdünnung meist in Nährboden, mit geringer Agarkonzentration (5 bis 10 g l -1 ) »Agar wird bei 45°C bis 50°C weich gehalten und beimpft, geschüttelt, ein entsprechendes Volumen entnommen und weiter überimpft – Verdünnungsreihe »Agar aushärten und Inkubieren

20 5. Anreicherung und Isolierung

21 Gewinnung von Reinkulturen: –bei Anaerobieren: Schüttelagarkultur: –Arbeitsweise: »einzelne Kulturen können mittels Spritze und Kanüle oder ausgezogener Pasteurpipette entnommen werden und z.B. in Flüssigmedium weiterkultiviert werden »Reinheitskontrolle v.a. mikroskopisch, grundsätzlich aber eher schwierig

22 Phasenkontrast Epifluoreszenz

23 5. Anreicherung und Isolierung Bestimmung der Zellzahl eines Habitates –Die Gemeinschaft eines Habitats umfasst meist eine Vielzahl nebeneinander lebender, aber auch toter (geschädigter bzw. nicht mehr vermehrungsfähiger) Zellen –es wird die Gesamtheit der Zellen bestimmt –dafür notwendig: homogene Probe repräsentative Probe

24 5. Anreicherung und Isolierung Bestimmung der Zellzahl –Probennahme, -handhabung, -aufbewahrung: viele Möglichkeiten zur Entnahme – Fachliteratur für Böden, Gewässer, anaerobe Habitate, etc. beim Transport muss eine Veränderung der Probe (chemisch, v.a. aber mikrobiologisch) verhindert werden (Kühlung, Fixieren?) Flüssigproben werden meist gut geschüttelt um eine homogene Verteilung der MO zu erreichen feste bzw. pastöse Proben werden meist mit Wasser/phys. NaCl-Lsg. verdünnt und anschließend geschüttelt Lagerung dann meist im Kühlschrank (4°C) oder bei -20°C

25 5. Anreicherung und Isolierung Bestimmung der Zellzahl –Methode: Thoma-Kammer Objektträger mit definiertem Volumen und Flächengravur

26 5. Anreicherung und Isolierung Bestimmung der Zellzahl –Methode: Thoma-Kammer Herstellen einer entsprechenden Verdünnung Thoma-Kammer mit EtOH sehr gründlich reinigen: fettfrei Deckglas an den Seitensteg pressen, ev. reiben bis das Deckglas fest sitzt (bunte Ringe), Umdrehen möglich –nur so entspricht das angegebene Volumen dem tatsächlichen!!! Suspension gut durchmischen eine Tropfen Suspension an den Deckglasrand unter Mikroskop die Zellen zählen: Phasenkontrast Auswertung: –Berechnung der ZZ für ausgezähltes Volumen –Hochrechnen auf 1 ml Zellsuspension

27 5. Anreicherung und Isolierung Bestimmung der Zellzahl –Methode: Thoma-Kammer Rechenbeispiel: –Kammer: a = 0,05 mm, h = 0,01 mm (angegeben ist immer das Kleinquadrat (KG)) –Verdünnungsstufe 1:10 = –pro Großquadrat werden 64 Zellen ausgezählt –64 : 16 = 4 Zellen/KQ –Fläche KQ: 0,05 * 0,05 * 0,01 = 0, mm 3 –1 mm 3 = 1 µl –4 Zellen : 0, = = 1,6 * 10 5 Zellen / µl –1,6 * 10 5 Zellen : = 1,6 * 10 6 Zellen / µl; –entspricht 1,6 * 10 9 Zellen pro ml

28 5. Anreicherung und Isolierung Bestimmung der Zellzahl –Methode: Membranfilter bei geringen Zelldichten Zellsuspension wird (meist mittels Spritze) durch eine Membranfilter gepresst (spezielle Filterhalter) – für kleine Volumina bei großen Volumina über Filterstation die Zellen werden (meist) angefärbt Zählung unter dem Mikroskop Acridin-Orange Färbung Färbung mit Erythrosin

29 5. Anreicherung und Isolierung Bestimmung der Zellzahl –Methode: Membranfilter Acridin-Orange Färbung: –Aufnahme der in der Suspension enthaltenen Zellen auf ein Membranfilter 0,2 µm (Spritze) –Eintauchen in verdünnte Acridin-Orange Lsg. –waschen mit A.d. –10 min einwirken lassen (Penetration der Zellen mit AO) –auf einen Objektträger aufbringen –mit Immersions-Öl überschichten –Deckglas –mit einem Epifluoreszenz-Mikroskop auszählen –Anregung mit UV –AO interkaliert mit DNA in der Zelle (bindet an Pi des NS), DNA wird angefärbt –Einzelstr.: orange –Doppelstr.: grün

30 5. Anreicherung und Isolierung Bestimmung der Zellzahl –Methode: Membranfilter Färbung mit Erythrosin –zur Färbung von Plasmaproteinen –hoher Iodanteil, Farbeffekt wird durch Phenol verstärkt –Membranfilter nicht angefärbt Vitalfärbung mit Fluorescein –unpolarer, hydrophober Ester- nicht fluoreszierend –geht durch Cytoplasmamembran –wird in der Zelle hydrolysiert - fluoreszierend

31 5. Anreicherung und Isolierung Bestimmung der Keimzahl (cfu) –auch als Lebendzellzahl bezeichnet –es werden nur vermehrungsfähige, kultivierbare (!!!) MO erfasst –meist makroskopische, daher sehr schnelle und einfache Auswertung möglich –höherer Zeitaufwand für die Vorbereitung notwendig –Weiterarbeiten mit kultivierten Organismen möglich

32 5. Anreicherung und Isolierung Bestimmung der Keimzahl –Methode: cfu Bestimmung Arbeitsweise: –Herstellen einer Verdünnungsreihe (vom Habitat abhängig, meist aber zw und ) –Ausplattieren auf ein geeignetes Medium (Drigalski- Spartel) »meist 0,1 ml oder 0,05 ml »meist in mehreren Parallelen (3 oder 5) »Medium für Pilze, Bakterien,… »Habitat: Wasser, Boden, Kompost, Schlamm, … »Selektion über Medium

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34 5. Anreicherung und Isolierung Bestimmung der Keimzahl –Methode: cfu Bestimmung Arbeitsweise: –Inkubation bei entspr. Temp. »Boden: 15 °C bis 20 °C »Gletschervorfeld: 10 °C »Gletscher: 4°C –Bebrütungsdauer: »mehrere Stunden bis mehrere Wochen (meist 1 bis 5 Tage) »Einfluss auf die Kolonien – nicht alle Zellen wachsen gleich schnell »bei zu kurzen Bebrütungszeiten können Kolonien übersehen werden »bei zu langer Bebrütungszeit überwachsen Kolonien andere

35 5. Anreicherung und Isolierung Bestimmung der Keimzahl –Methode: cfu Bestimmung Arbeitsweise: –Auswertung: es werden so genannte cfu – colony forming units – makroskopisch gezählt und auf einen ml hochgerechnet –verwendet werden jene Platten, die zw. 10 und 100 cfu aufweisen, hier werden alle Parallelen ausgezählt

36 5. Anreicherung und Isolierung Verd: -3 Verd: -4 Verd: -5 alle Kollonien (cfu) zählen und Keimzahl pro ml Ausganssuspens ion berechnen zw. 10 und 100 cfu

37 5. Anreicherung und Isolierung Bestimmung der Keimzahl –Methode: cfu Bestimmung Arbeitsweise: –Rechenbeispiel: »es wurden 0,1 ml (100 µl) einer Suspension der Verdünnungsstufe ausgespartelt »Verdünnungsstufe ergibt: 14, 20 und 17 cfu je Parallelplatte »Bildung des Mittelwertes: 17 (Mittelwert darf nur INNERHALB VON PARALLELPLATTEN, nicht aber zwischen Verdünnungsstufen gebildet werden(!!!!)) »Rechnung:17 / 0,1 = 1,7 * 10 2 / = 1,7 * 10 6 cfu / ml

38 5. Anreicherung und Isolierung Bestimmung der Keimzahl –Methode: Membranfiltertechnik wenn niedrige Keimzahlen zu erwarten sind häufig in der Wasseranalytik eingesetzt Arbeitsweise: –spezielle Filtereinheit –am Filter werden MO immobilisiert –verschiedene Filter können verwendet werden, möglichst mit Gitternetz (Raster) –Filter auf Agarplatte gelegt und inkubiert –Auswertung wie bei cfu Bestimmung, wobei das Ergebnis für das gesamte filtrierte Volumen gilt

39 5. Anreicherung und Isolierung Membranfiltertechnik

40 5. Anreicherung und Isolierung Bestimmung der Keimzahl –Methode: Membranfiltertechnik wenn nach der Bebrütung die Kolonien auf einem weißen Filter zu wenig Kontrast zeigen, können diese auch angefärbt werden: –Malachitgrün: Filter direkt in der Petrischale mit einer 0,01% Malichtgrün Lsg. überschichten –ca. 10 sek einwirken lassen –Kolonien bleiben ungefärbt –Filter wird grün –Auszählen wird stark erleichtert (Unterscheidung wird einfacher)

41 5. Anreicherung und Isolierung Bestimmung der Keimzahl –Methode: Membranfiltertechnik Konservierung das Filter kann nach Auswertung getrocknet werden (30 min bei 120°C tötet vegetative Zellen – nicht Endosporen!!!!) auf eine Kartonplatte aufgeklebt über Jahre haltbar häufig in der Lebensmittel- und Wasseranalytik eingesetzt – Dokumentation!!!

42 5. Anreicherung und Isolierung Bestimmung der wahrscheinlichsten Keimzahl –Methode: most probable number (MPN) statistische Methode, die einen Schätzwert über die wahrscheinlichste Keimzahl liefert für Proben mit niedrigen Ausgangskeimzahlen: Wasserproben, Lebensmittel, pharmazeutische Produkte basierend auf der Verdünnung in einem Nährmedium –meist sehr selektiv, um nur eine bestimmte Gruppe zu bestimmen: z.B. Coliforme in Lebensmitteln wenn eine Trübung nach erfolgter Inkubation feststellbar ist, dann ist diese Probe positiv

43 5. Anreicherung und Isolierung Bestimmung der wahrscheinlichsten Keimzahl –Methode: most probable number (MPN) üblicherweise werden die Verdünnungen in mehreren Parallelen angelegt –in Reagenzgläsern (Eprouvetten): mind. 3, meist 5 Par. –Mikrotiterplatten (96 well Platten: 12 x 8 Näpfchen) Verdünnung in Dezimalschritten (meist 9 ml Nährlösung plus 1 ml Suspension – 1:10)

44 5. Anreicherung und Isolierung Bestimmung der wahrscheinlichsten Keimzahl –Methode: most probable number (MPN) bis zu einer bestimmten Verdünnungsstufe sind sämtliche Röhrchen getrübt (=bewachsen =positiv), d.h. dass in dieser Verdünnungsstufe bereits vor Inkubation mind. 1 lebensfähige Zelle zu finden war in darüber liegenden Stufen sind nicht alle Röhrchen positiv es werden ausgehend von der letzten Verdünnungsstufe, in der Wachstum sichtbar ist, die darunter liegenden positiven Parallelen gezählt Auswertung über Statistiktabellen

45 5. Anreicherung und Isolierung Bestimmung der wahrscheinlichsten Keimzahl –Methode: most probable number (MPN) soll eine bestimmt Organismengruppe bei gleichzeitiger Anwesenheit von Fremdkeimen ausgewertet werden, kann beispielsweise nicht die Trübung gemessen, sondern auf Basis der Produktion von Säure/Base, Gasen usw. vorgegangen werden es können Indikatoren angewendet werden (Sre/Base, Redox, ….)

46 5. Anreicherung und Isolierung Bestimmung der wahrscheinlichsten Keimzahl –Methode: most probable number (MPN)

47 5. Anreicherung und Isolierung Bestimmung der wahrscheinlichsten Keimzahl –Methode: most probable number (MPN) Vorraussetzung für die erfolgreiche Anwendung von MPN Methoden: –homogene Verteilung der Organismen in der Ausgangsprobe (Suspension) –Zellen liegen möglichst einzeln vor und nicht in Agglomeraten –Zellen sind nicht oder nur minimal an Partikel gebunden –theoretisch sollte beim Vorhandensein von nur 1 Zelle in einem Röhrchen eine Trübung beobachtet werden können die besten Ergebnis werden erzielt, wenn in einer Verdünnungsreihe 20% aller Röhrchen negativ sind (1,6 Keime in der entsprechenden Verdünnungsstufe)

48 5. Anreicherung und Isolierung Bestimmung der wahrscheinlichsten Keimzahl –Methode: most probable number (MPN) Vorteile: –bei schwer auf festen Nährmedien kultivierbaren Organismen –wenn die Begleitflora nicht oder nur schwer auf Selektivnährböden gehemmt werden kann –wenn die zu untersuchenden Keime langsam wachsen, sprich überwachsen werden könnten

49 5. Anreicherung und Isolierung Bestimmung der wahrscheinlichsten Keimzahl –Methode: most probable number (MPN) Nachteile: –zeit- und materialintensiv –sind antibiotisch wirksame Substanzen (v.a/ auch abiotische Faktoren) in der Ausgangssuspension vorhanden kann die Methode nicht angewendet werden – Membranfiltertechnik hier anzuwenden –die Methode ist bei Verwendung von Dezimalverdünnungen sehr ungenau – besser wären kleiner Verdünnungsschritte

50 5. Anreicherung und Isolierung Bestimmung der Zellmasse –Biomasse-Quantifizierung –in Flüssigmedien –Bestimmung von Zellerträgen in einer statischen oder auch kontinuierlichen Kultur –meist als Bezugsgröße für Kulturparameter wie Sauerstoffzehrung, Enzymaktivität, morphologische Phänomene, … –v.a. für Reinkulturen eingesetzt –in ökologischer Anwendung schwer einsetzbar

51 5. Anreicherung und Isolierung Bestimmung der Zellmasse –Zellmasse bezogen auf das Kulturvolumen – Zelldichte (z.B. mg/ml oder g/l) –es kann meist nicht zw. lebenden und toten Zellen differenziert werden –oftmals nicht einmal die Möglichkeit, zw. biotischen und abiotischen Bestanteilen im Medium zu differenzieren

52 5. Anreicherung und Isolierung Bestimmung der Zellmasse –Feuchtmassebestimmung: gravimetrisch meist durch Zentrifugation, seltener durch Filtration sehr schnelle Ergebnisse Wassergehalt der Zellen variabel(!!) – Vergleichbarkeit Pathogene (!!)

53 5. Anreicherung und Isolierung Bestimmung der Zellmasse

54 5. Anreicherung und Isolierung Bestimmung der Zellmasse –Trockenmassebestimmung: sehr häufig eingesetzte, zuverlässige Methode gravimetrisch Abtrennung der MO von der Flüssigphase (Medium): –Zentrifugation: »ev. Waschschritt(e): NaCl, Wasser, … »Tarierwaage (!!) »homogene Suspension (!!) »je nach Rotor 4000 bis 6000 g für Bakt., ca für Hefen –Filtration: »meist in Faltenfiltern Trocknung bei 105° C

55 5. Anreicherung und Isolierung Bestimmung der Zellmasse –Trockenmassebestimmung: nach 12 bis 24 Stunden abwiegen (mg) im Exsikkator abkühlen lassen Berechnung: –für TM müssen die Leergewichte bekannt sein (tara) –vom ermittelten Gesamtgewicht zieht man das Leergewicht ab –Bezug auf FG, oder auf gesamt zentrifugiertes/ filtriertes Volumen

56 5. Anreicherung und Isolierung Trübungsmessung –NL idR klar –beimpfte NL erscheint ab einem bestimmten Zeitpunkt trübe (Bakt. ca. ab 10 6 Zellen/ml) –Zellen in der NL streuen das Licht –diese Streuung verringert die Intensität eines gerichteten Lichtstrahls durch die Lsg. –Abnahme der Lichtintensität zur Zelldichte proportional –Intensitätsabnahme mittels Photometer gemessen

57 5. Anreicherung und Isolierung Trübungsmessung –eingesetzt für: homogene Susp. von Bakterien, Hefen, Sporen zur Abschätzung/Messung von Wachstum Gewinnung von Impfkulturen die Standardisierung von Bakteriensuspensionen Evaluation von z.B. wachstumshemmenden Stoffen –nicht für myzelbildende MO –Vorteile: schnell zuverlässig ohne Schädigung oder Abtötung der untersuchten Zellen

58 5. Anreicherung und Isolierung Trübungsmessung –Photometer Gerät zur photoelektrischen Messung von monochromatischen Lichtströmen gemessen wird die Extinktion Auslöschung bei Trübungsmessung aber nicht durch Absorption des Lichts, sondern durch Streuung

59 5. Anreicherung und Isolierung Trübungsmessung –Photometer

60 5. Anreicherung und Isolierung Trübungsmessung –Photometer: Küvetten: –Glas: Borsilicatglas 340 – 2500 nm –Quarzglas: 190 – 2500 nm –Kunststoff: 300 – 750 nm

61 5. Anreicherung und Isolierung Trübungsmessung –Photometer: Trübungsmessung: –10 6 bis Zellen/ml –Entnahme kurz vor Messung (ev. Kühlung) –homogene Lsg. –Veränderung der Probe vermeiden: Wachstum –Lyse der Zellen - Protoplasten –Je kleiner die Wellenlänge, desto größer die Streuung (= scheinbare Extinktion) »bei niedrigen Zelldichten ab 420 nm »bei hohen Zelldichten 660 nm –Medium darf kein Licht absorbieren

62 5. Anreicherung und Isolierung Trübungsmessung –Photometer: Trübungsmessung: –vor Messung Lsg. gut schütteln –Luftblasen –Referenz –Nullabgleich –Messung durchführen –Zeitintervall – konstanter Wert


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