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Expressionssystem Escherichia coli /protocols/Novagen_petsystem.pdf Rekombinantes Protein Molecular Biology of the.

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Präsentation zum Thema: "Expressionssystem Escherichia coli /protocols/Novagen_petsystem.pdf Rekombinantes Protein Molecular Biology of the."—  Präsentation transkript:

1 Expressionssystem Escherichia coli /protocols/Novagen_petsystem.pdf Rekombinantes Protein Molecular Biology of the Cell, Fifth Edition (© Garland Science 2008) Escherichia coli Figure 3-10 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)

2 Escherichia coli Prokaryot Gramnegatives Enterobakterium Einfache Klonierung Kurze Generationszeit Einfaches Screening Figure 1-18a Molecular Biology of the Cell, Fifth Edition (© Garland Science 2008)

3 Escherichia coli BL21[DE3] BL21: Fehlende Proteasen Induzierbarkeit (IPTG) Kompatibel mit allen pET-Vektoren Figure 1-18a Molecular Biology of the Cell, Fifth Edition (© Garland Science 2008)

4 Expressionsvektor MCS: Multiple Cloning Site His-tag coding sequnece T7 Promotor Ori: Bakterieller Replikationsursprung Sm: Antibiotika-Selektionsmarker lacI: lac-Repressor pCDFDuet #documentation

5 Induzierbarkeit IPTG T. Dingermann: Gentechnik, Biotechnik, 2011; WVG Stuttgart E. coli BL21(DE3) T7 RNA-Polymerase unter lac-Promotor

6 Induktion durch IPTG

7 Klonierungsstrategie pCDFDuet #documentation

8 Schnittstellen? Reading frame? Klonierungsstrategie Gene of interestHis GOI codiert für SGD (STR-Glukosidase) His-Tag zur affinitätschromatographischen Aufreinigung

9 Reinigung von Proteinen Aufreinigung von Proteinen nach: Löslichkeit Größe Ladung Bindeaffinität IMAC (Immobilized Metal Ion Affinity Chromatography) Natürliche Tendenz von Histidin mit zweiwertigen Ionen zu komplexieren Histidin: Figure 8-13 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)

10 Affinitätschromatographie Recombinant protein His tag Ni-IDA

11 Affinitätschromatographie Imidazol Ni-IDA Imidazole Recombinant protein i/Imidazol

12 12 Ma X et al. Plant Cell 2006;18: (modified) Monoterpenindolalkaloide

13 Vinblastine and Vincristine 13 Tryptophan Decarboxylase Strictosidine Synthase Strictosidine Glucosidase Strictosidin Glucosidase

14  Medically important substances  Isolated from Catharanthus roseus Vinca alkaloids: Vinblastine and Vincristine Anticancer drugs: → Spindle Poisons ! 14 Spindelgifte

15 Proteinexpression in Escherichia coli: Einfache und schnelle Klonierung und Transformation Vielzahl an Plasmiden erhältlich (mit Tags und Fusionsgenen) Induzierbare Expression großer Mengen rekombinanter Proteine (T7 Promotor) Einfache Extraktion der Proteine (nativ oder denaturierend) Zur Produktion rekombinanter Arzneistoffe oder zum rekombinanten Nachbilden pflanzlicher sekundärer Stoffwechselwege Zusammenfassung

16

17 Klonierung (Restriktion, Ligation) Transformation in E. coli Proteinexpression in E. coli Proteinextraktion Affinitätschromatographie Proteinexpression

18 Transformation Einfache und schnelle Durchführung (kit-basiert) Hohe Transformationseffizienz Chemische Transformation chemisch kompetente Zellen Behandlung mit CaCl 2 Aufnahme von DNA- Fragmenten in die Zelle


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