Expressionssystem Escherichia coli

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1 Expressionssystem Escherichia coli
Rekombinantes Protein Escherichia coli Figure Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008) Molecular Biology of the Cell, Fifth Edition (© Garland Science 2008)

2 Escherichia coli Prokaryot Gramnegatives Enterobakterium
Einfache Klonierung Kurze Generationszeit Einfaches Screening Figure 1-18a Molecular Biology of the Cell, Fifth Edition (© Garland Science 2008)

3 Escherichia coli BL21[DE3]
Fehlende Proteasen Induzierbarkeit (IPTG) Kompatibel mit allen pET-Vektoren Figure 1-18a Molecular Biology of the Cell, Fifth Edition (© Garland Science 2008)

4 Expressionsvektor pCDFDuet-1 MCS: Multiple Cloning Site
His-tag coding sequnece T7 Promotor Ori: Bakterieller Replikationsursprung Sm: Antibiotika-Selektionsmarker lacI: lac-Repressor pCDFDuet-1

5 Induzierbarkeit IPTG E. coli BL21(DE3) T7 RNA-Polymerase
unter lac-Promotor T. Dingermann: Gentechnik, Biotechnik, 2011; WVG Stuttgart

6 Induktion durch IPTG

7 Klonierungsstrategie
pCDFDuet-1

8 Klonierungsstrategie
Gene of interest His Schnittstellen? Reading frame? GOI codiert für SGD (STR-Glukosidase) His-Tag zur affinitätschromatographischen Aufreinigung

9 Reinigung von Proteinen
IMAC (Immobilized Metal Ion Affinity Chromatography) Natürliche Tendenz von Histidin mit zweiwertigen Ionen zu komplexieren Aufreinigung von Proteinen nach: Löslichkeit Größe Ladung Bindeaffinität Histidin: Figure Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)

10 Affinitätschromatographie
Recombinant protein His tag Ni-IDA 2. 3. 1. 1. 3. 2.

11 Affinitätschromatographie
Recombinant protein Imidazol Imidazole Ni-IDA

12 Monoterpenindolalkaloide
Ma X et al. Plant Cell 2006;18: (modified)

13 Strictosidin Glucosidase
Tryptophan Decarboxylase Strictosidine Synthase Strictosidine Glucosidase Vinblastine and Vincristine

14 Spindelgifte Anticancer drugs:  Medically important substances
 Isolated from Catharanthus roseus Vinca alkaloids: Vinblastine and Vincristine Anticancer drugs: → Spindle Poisons !

15 Zusammenfassung Proteinexpression in Escherichia coli:
Einfache und schnelle Klonierung und Transformation Vielzahl an Plasmiden erhältlich (mit Tags und Fusionsgenen) Induzierbare Expression großer Mengen rekombinanter Proteine (T7 Promotor) Einfache Extraktion der Proteine (nativ oder denaturierend) Zur Produktion rekombinanter Arzneistoffe oder zum rekombinanten Nachbilden pflanzlicher sekundärer Stoffwechselwege

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17 Proteinexpression Klonierung (Restriktion, Ligation)
Transformation in E. coli Proteinexpression in E. coli Proteinextraktion Affinitätschromatographie

18 Transformation Chemische Transformation chemisch kompetente Zellen
Behandlung mit CaCl2 Aufnahme von DNA-Fragmenten in die Zelle Einfache und schnelle Durchführung (kit-basiert) Hohe Transformationseffizienz