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Pia, Sarah, Lisa Biologie Lk 16.03.2007 1. 2 Gliederung 1.Einleitung 1.Einleitung 2.Was ist ein Plasmid? 2.Was ist ein Plasmid? 3. Klonierung 3. Klonierung.

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1 Pia, Sarah, Lisa Biologie Lk

2 2 Gliederung 1.Einleitung 1.Einleitung 2.Was ist ein Plasmid? 2.Was ist ein Plasmid? 3. Klonierung 3. Klonierung 3.1. Was ist Transformation? 3.1. Was ist Transformation? 4. Klonierung des lacZ-Gens 4. Klonierung des lacZ-Gens 5.Versuchsanleitung 5.Versuchsanleitung 6.Versuchsauswertung 6.Versuchsauswertung 7.Quellen 7.Quellen

3 Pia, Sarah, Lisa Biologie Lk Was ist ein Plasmid? Plasmide werden als Vektoren bezeichnet Plasmide werden als Vektoren bezeichnet Extrachromosomal, autonom replizierende, doppelsträngige, ringförmige DNA-Moleküle Extrachromosomal, autonom replizierende, doppelsträngige, ringförmige DNA-Moleküle Verleiht dem Bakterium verschiedene Eigenschaften (Resistenz gegen Antibiotika) Verleiht dem Bakterium verschiedene Eigenschaften (Resistenz gegen Antibiotika) Kodieren für eine Reihe von Merkmalen Kodieren für eine Reihe von Merkmalen Von einem Plasmid gibt es mehrere 100 Kopien pro Zelle Von einem Plasmid gibt es mehrere 100 Kopien pro Zelle Bakterien geben Plasmide weiter Bakterien geben Plasmide weiter

4 Pia, Sarah, Lisa Biologie Lk Plasmide dienen der Einführung von DNA in eine fremde Zelle Plasmide dienen der Einführung von DNA in eine fremde Zelle Wichtige Bereiche des Plasmids: Replikations-Sequenz, Antibiotika- Resistenz-Gen, Klonierungs-Stelle Wichtige Bereiche des Plasmids: Replikations-Sequenz, Antibiotika- Resistenz-Gen, Klonierungs-Stelle Es gibt drei Formen, Plasmide nach der Isolierung nachzuweisen: superhelikase, relaxiert, linearisiert Es gibt drei Formen, Plasmide nach der Isolierung nachzuweisen: superhelikase, relaxiert, linearisiert

5 Pia, Sarah, Lisa Biologie Lk

6 6 3. Klonierung Zentraler Schritt: Einführung von DNA- Molekülen in Bakterien Zentraler Schritt: Einführung von DNA- Molekülen in Bakterien Bakterien können DNA nur in begrenztem Umfang aufnehmen Zellen werden physikalisch und/oder chemisch behandelt Bakterien können DNA nur in begrenztem Umfang aufnehmen Zellen werden physikalisch und/oder chemisch behandelt dadurch können sie besser DNA aufnehmen dadurch können sie besser DNA aufnehmen

7 Pia, Sarah, Lisa Biologie Lk Methode funktioniert nur, wenn Bakterienzellen einer sehr frühen Wachstumsphase benutzt werden Methode funktioniert nur, wenn Bakterienzellen einer sehr frühen Wachstumsphase benutzt werden Bakterien werden nach einer solchen Behandlung als kompetent bezeichnet Bakterien werden nach einer solchen Behandlung als kompetent bezeichnet Herstellung kompetenter Zellen: Herstellung kompetenter Zellen: unter Zugabe von Calciumchlorid wird die Zellwand durchlässig (kompetent) unter Zugabe von Calciumchlorid wird die Zellwand durchlässig (kompetent) DNA kann aufgenommen werden DNA kann aufgenommen werden

8 Pia, Sarah, Lisa Biologie Lk Was ist Transformation? Aufnahme von DNA in Zellen Aufnahme von DNA in Zellen Einige der Bakterien nehmen DNA auf, wenn man DNA und kompetente Bakterien mischt Einige der Bakterien nehmen DNA auf, wenn man DNA und kompetente Bakterien mischt Danach plattiert man die Bakterien auf ein selektives Medium, das die Erkennung von rekombinanter Klonen erlaubt Danach plattiert man die Bakterien auf ein selektives Medium, das die Erkennung von rekombinanter Klonen erlaubt

9 Pia, Sarah, Lisa Biologie Lk Klonierung des lacZ-Gens

10 Pia, Sarah, Lisa Biologie Lk Versuchsanleitung

11 Pia, Sarah, Lisa Biologie Lk

12 Pia, Sarah, Lisa Biologie Lk Versuchsauswertung Selektion (Auslese): es werden Plasmide verwendet, die ein zu klonierendes Gen und mehrere Selektionsmarker tragen ( z.B. Resistenzgen für bestimmte Antibiotika) Selektion (Auslese): es werden Plasmide verwendet, die ein zu klonierendes Gen und mehrere Selektionsmarker tragen ( z.B. Resistenzgen für bestimmte Antibiotika) Ohne Selektion können nicht transformierte Bakterien auf dem Nährboden wachsen Ohne Selektion können nicht transformierte Bakterien auf dem Nährboden wachsen Mit Selektion können nur transformierte Bakterien auf dem Nährboden wachsen Mit Selektion können nur transformierte Bakterien auf dem Nährboden wachsen Auszählung der Kolonien und Berechnung der Transformationsrate Auszählung der Kolonien und Berechnung der Transformationsrate

13 Pia, Sarah, Lisa Biologie Lk Quellen Blue Genes, Fonds der chemischen Industrie Blue Genes, Fonds der chemischen Industrie XLAB, Göttinger Experimentallabor für junge Leute e.V., Dr. Eva Corinna Feil XLAB, Göttinger Experimentallabor für junge Leute e.V., Dr. Eva Corinna Feil

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