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DNA - Sequenzierstrategien Von Theresa Köhler. Was ist Sequenzieren? Bestimmen der Basensequenz eines DNA - oder RNA -Strangs Schlussfolgerung auf Aminosäuresequenz.

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1 DNA - Sequenzierstrategien Von Theresa Köhler

2 Was ist Sequenzieren? Bestimmen der Basensequenz eines DNA - oder RNA -Strangs Schlussfolgerung auf Aminosäuresequenz in einem Protein Identifikation von Genen und kleinsten Veränderungen im Genom

3 Wozu braucht man Strategien ? Genome sind zu groß, um in einem einzigen Schritt sequenziert werden zu können eine Sequenzierungsreaktion (read'): ca. 600 Nukleotide Genomgrößen: –Escherichia coli: 4,64 Mb –Saccharomyces cerevisiae: 12,1 Mb –Arabidopsis thaliana: 125 Mb –Homo sapiens: 3200 Mb –Triticum aestivum: 17000Mb

4 Strategien Shot-Gun-Methode Chromosome Walking Clone Fingerprinting Nested Deletion Delta-Restriktionsklonierung

5 Shot-Gun-Methode Das Genom wird nach Zufallsprinzip in kurze Fragmente (1,6 – 2,0 kb) zerbrochen (Restriktionsend onukleasen, Ultraschall) Klonierung Sequenzierung Suche nach Überlappungen

6 Shot-Gun-Methode Vorteil: –schnelle Analyse der Fragmente Nachteile: –Ermittlung der Gesamtsequenz bedarf enormen Computeraufwand, um anhand von Überlappungen die Gesamtsequenz zu erhalten –Sich wiederholende Sequenzen im Genom können falsch eingeordnet werden oder völlig übergangen –Lücken können auftreten

7 Chromosome Walking Bekanntes DNA-Stück wird langsam mit Hilfe von Hybridisierungssonden erweitert Wahl eines beliebigen Klons aus der Bibliothek Markierung Verwendung als Sonde für alle anderen Klone in Bibliothek Suche nach Überlappungen erneute Markierung und Hybridisierung

8 Chromosome Walking Vorteile: – Position und Laufrichtung der Sequenz sind jederzeit bekannt. –Redundanz von 2 durch die zusätzliche Anbringung von Primern in Gegenrichtung, s.d. der komplementäre Sequenzstrang bestimmt werden kann Nachteil: –Arbeitsaufwändig, da Sequenzdaten nur Schritt für Schritt erhalten werden können (bis 200 kb) –Synthese eines neuen Primers für jede Reaktion

9 Clone Fingerprinting Nachweis von Sequenzelementen, die zwei Klonen gemeinsam sind Behandlung mit Restriktionsendonukleasen Suche nach Fragmenten gleicher Größe Vorteile: –schneller –Keine feste Ausgangsposition Nachteile: –Hoher Arbeitsaufwand, Agarosegele nach gleichgroßen Fragmenten zu untersuchen

10 Clone Fingerprinting

11 Nested Deletion Behandlung mit Exonukleasen zur Verkürzung (Deletion) Probenentnahme in regelmäßigen Abständen Vorteil: –Nur ein Standard-Primer wird benötigt –Repetive Sequenzen werden nicht übersehen

12 Delta-Restriktionsklonierung Zerkleinerung des DNA - Fragment und GelAnalyse Verkürzung des Klons durch Kopplung mit bestimmten Enzymen Lage der Verkürzungen weist unter Verwendung von Standardprimern auf die Sequenz hin

13 Literatur S.B.Primose – Genomanalyse T.Strachan – Das menschliche Genom T.A.Brown – Genomes 2nd Edition


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