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Strukturbasiertes phage display. Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg Institut für Biotechnologie Arbeitsgruppe Proteintechnologie Ulrike Fiedler.

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Präsentation zum Thema: "Strukturbasiertes phage display. Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg Institut für Biotechnologie Arbeitsgruppe Proteintechnologie Ulrike Fiedler."—  Präsentation transkript:

1 Strukturbasiertes phage display

2 Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg Institut für Biotechnologie Arbeitsgruppe Proteintechnologie Ulrike Fiedler Gerald Böhm Rainer Rudolph Carola Reimann

3 Phage display und panning lösliches Protein eluierter Phage Selektionsprozess

4 Light chain Heavy chain Intra-chain- disufide bonds Inter-chain disulfide bond Active site Structure of Antibody Molecules Complete antibody IgG molecule Catalytic antibody

5 Application of Antibodies Diagnostics Therapy Monitoring Purification tumour diagnosis ELISA cancer detection and quantification of bacteria, toxins, viruses, pesticides affinity chromatography bioremediation

6 Antibodies Affinity Specificity Size Immunogenicity Low stability AdvantagesDisadvantages

7 Phagenspezies für das phage display filamentöse Phagen lytische Phagen periplasmatisch zytoplasmatisch Plasmamembran äußere Membran Expression in der E. coli-Zelle

8 Verwendung von single-chain Fv Antikörpern beim phage display

9 Anwendungen des phage display-Systems Display natürlicher Peptide: Epitop-Mapping von Antikörpern Herstellung von Immunogenen Display von Random-Peptiden: Epitop-Mapping von Antikörpern Identifizierung von Peptid-Liganden Mapping der Substratbindungsstelle von Proteasen und Kinasen Display von Proteinen und Isolierung von hoch-affinen Antikörpern Protein-Domänen: cDNA Expressions-Screening directed Evolution

10 Cytochrome b 562 Tendamistat Z-Domäne vom Protein A Cys 2 His 2 - Zink-Finger Scaffolds für das phage display Zn

11 Ziel des Projektes Design eines stabilen Proteins mit Bindungseigenschaften Anforderungen an das Scaffold-Protein: - kleines Protein - hohe Stabilität - geringe Immunogenität

12 Das Augenlinsenprotein Gamma-Kristallin - ein scaffold für das phage display?

13 sehr stabiles Protein kleines Protein kaum immunogen Kristallstruktur vorhanden 174 Aminosäuren 2 Domänen 4 -Faltblätter mit jeweils 4 -Strängen (greek-keay) Eigenschaften des Gamma-Kristallins Gamma-Kristallin als scaffold: stabiles Protein ohne Bindungseigenschaften

14 Solvent Accessibility Accessibility (% of max.) Residues 1-85 (N-terminal domain)

15 Inside Outside Sequence Variability

16 Mutagenese im -Faltblatt Ser 19 Mutagenisierte Positionen: Lys 2 Thr 4 Tyr 6 Cys 15 Glu 17 Ser 19 Arg 36 Asp 38 Anzahl der möglichen Varianten: 20 8 = 2.6 E+10

17 Ort der Mutagenense Oberfläche des Gamma- Kristallins: 9122 Å 2 Mutagenisierter Bereich: 560 Å 2 = 6,1%

18 Konstruktion einer kombinatorischen Gamma-Kristallin-Bank Design der Oligonukleotide Assemblierung Klonierung Expression and Selektion X X X X X X X X X X X X X X X X X

19 Assemblierung der Oligonukleotide X X X X X X X X X X Assemblierung an der Festphase SA-coated paramagnetic bead X X X Kodon-Nutzung N/N/N - 64 Kodone für eine Aminosäure CAT/N/N - kein Stop-Kodon, kein Cystein, keine aromatischen Aminosäuren N/N/K (T or G) - 32 Kodone für eine Aminosäure Tripletts - 20 Kodone für eine randomisierte Amiosäure

20 Ergebnisse und Probleme Herstellung der Bank Größe der Bank Qualität der eingesetzten Oligos Expression der mutierten Proteinen Etablierung des phage display-Systems (scFv) Bildung des Fusionsproteins Display auf dem Phagen Gamma-Kristallin-WT-Protein 3 Stabilität der mutierten Proteine PanningSelektion geeigneter Targets und panning-Bedingungen

21 Target Molecules Haptens oxazolone, abscisic acid, biotin, digoxigenin, testosterone Proteins BSA, Il4-receptor CEA (carcinoembryonic antigen) tetanus toxoid SH2-domain EGF-receptor Glycoproteins EGP 2 (epithelial glycoprotein)

22 Erste Zielmoleküle Haptene: Oxazolone Biotin Proteine: BSA Lysozym CD 44 (Oberflächenprotein bei Krebszellen) EnzymatischeGlucosidase Aktivitäten:

23 Weiterführende Arbeiten Gamma-Kristallin-Bänke unter Verwendung von Triplett-Oligonukleotiden Display einzelner Gamma-Kristallin-Domänen oder Gamma-Kristallin-Cystein-Mutanten auf dem Phagen Untersuchung der Wechselwirkungen mit dem BIACORE Stabilitätsuntersuchungen

24 Ausblick weitere Mutagenesen: loop-Region, Region zwischen N- und C-terminaler Domäne random - DNA-shuffling Fusion der isolierten Kristallin-Mutanten mit dem VP1-Molekül (Targeting Modul) Panning: an lebenden Zellen (zellspezifische Targeting-Module)


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