Die Präsentation wird geladen. Bitte warten

Die Präsentation wird geladen. Bitte warten

Etablierung neue Gene 1. Block-PCR 14.03.09 Annealing: 54°C; MgCl 2 4mM EJ28/5637 (1:2) Primer 0,5µM Gelbild Gradienten-PCR 15.03.09 55 5°C (50°C, 51,5°C,

Ähnliche Präsentationen


Präsentation zum Thema: "Etablierung neue Gene 1. Block-PCR 14.03.09 Annealing: 54°C; MgCl 2 4mM EJ28/5637 (1:2) Primer 0,5µM Gelbild Gradienten-PCR 15.03.09 55 5°C (50°C, 51,5°C,"—  Präsentation transkript:

1 Etablierung neue Gene 1. Block-PCR Annealing: 54°C; MgCl 2 4mM EJ28/5637 (1:2) Primer 0,5µM Gelbild Gradienten-PCR °C (50°C, 51,5°C, 53°C, 54°C, 55,5°C, 58°C, 60°C) UCA1: 3+4mM MgCl 2 : 5637 (1:3) (3 alte 5637) CK20: 4mM: 5637(1:2); EJ28+J82+RT4(1:2) nur 54°C;5mM: 5637 (1:2) CK wegschneiden Gelbild CK20 nur in RT4 Block-PCR (GA 20µl) °C, 3+4mM MgCl 2 UCA1: 5637 (1:3); CK20: RT4(1:3) Gelbild CK wegschneiden Block-PCR (GA 50µl) (für Gelelution) 56°C, 3mM MgCl 2 UCA1: 5637 (1:3); CK20: RT4(1:3) Gelbild ?

2 Gelelution, Ligation, Transformation, Ausplattieren Plasmidpräp und DNA-Konz.-Bestimmung (Photometer) CK20: ng/µl 5µl UCA1: / 128ng/µl 7,9/ 5µl Kontrollverdau (NotI, PK DE-A) Klone picken Gelbild Nicht geklappt, nur PK Agilent (DNA) ??? CK20=0 ; UCA1=4,8ng/µl Block-PCR mit Klonen Programm wie GA 50µl Gelbild UCA1 gut, CK20 nicht ok, weil 5637 falsches template Agilent (DNA) ??? Block-PCR mit neuen Klonen Für CK20, RT (1:2), Programm wie GA 50µl Gelbild ok CK20: 2; UCA1: 4

3 Gelelution, Ligation, Transformation, Ausplattieren 10 Klone picken Plasmidpräp+Konz.-Bestimmung am Photometer Kontroll-Block-PCR mit 10 Klonen RT4 (1:2), Programm wie GA 50µl Gelbild PK+NK gleich?! Sequenzierung UCA1 schlecht; CK20 okUCA1 2+4; CK kein KV!!! 32,5-55ng/µl LC-PCR mit 3 Kits RT4 (1:5), LC480, Klon 1 (Standardverdünnungsreihe 10e6-25), Annealing 56°C 10s (gleich ok gewesen endgültiges Programm CK20 LC-PCR EJ28 (?:?), Kapillarcycler, Klon 1(nicht sequenziert, aber Block-Fragment ok), Klon 4 (sequenziert Fragment nicht drin), Annealing ? UCA1 LC-BildCP bei allen 3 Kits gleich (480 Probes Master etw.später als TaqManMAster); PM+TMM höhere Fluoreszenz als DNA-HP-Master TMM 01CK20 Test Plasmid 1 01 Test UCA1 Plasmid 1 und 4 Nur in EJ28 Ursache nicht diePrimer + Sonden, sondern Klonierung LC-Bild

4 Keine DoppelbandenGelbild LC-PCR mit versch. ZL,Urinen, TURBT-Gewebe (RT4, RT 112, J82, EJ28, 5637, HT1376, HT1197) GelbildKeine Doppelbanden bei bd. Matrices Ausschluss falsche Rkt. 1-2 Standards, NK, PK Matrix-Test für Beschichtung (virale DNA) LC-Bild CP: Urin 24-36; Gewebe 27-40; ZL spät CP 21 als Beginn (entspr.10e5); 10e3,10e3,500 Beschichtung Platten+LC LC-PCR PK+NK+Standards GVO 449 Gelbild Keine Doppelbanden Oncoray TA-Vektor, 10 Klone Klonierungs-PCR Alle 10 Klone ok Animpfen von 5 Klonen ( ) Kontrollverdau EcoRI, 8,5µl DNA H10 Gelbild ok Sequenzierung Klon 1+10 ok LC-PCR mit 3 Kits+ABI-Kits+ ? ABI: Universal PCR MM NoAmp Erase, TaqMan Gene Expression Kit; EJ28 (1:5), LC480, Klon 1 (GFX-Kit; c62,5ng/µl, Standardverdünnungsreihe 10e6-?), Annealing ? (gleich ok gewesen endgültiges Programm 02 CK20 Test Plasmid 1 08 Test UCA1 Plasmid 1 und 4 TMM+480 Probes Master ok GVO 450 Viele Probleme mit Elution! GFX!!! LC-BildCP: ?

5 1.Block-PCR Gradienten-PCR Block-PCR (GA 20µl) Block-PCR (GA 50µl)... KV (CK20 5µl!) GELBILD (5 Klone) UCA1 als Bsp. Sequenzierung LC-PCR mit 3 Kits (bei UCA1 auch nur diese 3 anzeigen?!) + Gelbild CK20: LC-PCR mit versch. ZL GVO Beschichtung für CK20 (SP6T7) Agilentbild (Erklärung!!!) Kontroll-PCR } GELBILD


Herunterladen ppt "Etablierung neue Gene 1. Block-PCR 14.03.09 Annealing: 54°C; MgCl 2 4mM EJ28/5637 (1:2) Primer 0,5µM Gelbild Gradienten-PCR 15.03.09 55 5°C (50°C, 51,5°C,"

Ähnliche Präsentationen


Google-Anzeigen