Nucleotide sequence of human monocyte interleukin 1 precursor cDNA Isabel Doch Philip E. Auron, Andrew C. Webb, Lanny J. Rosenwasser, Steven F. Mucci,

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2 Nucleotide sequence of human monocyte interleukin 1 precursor cDNA Isabel Doch Philip E. Auron, Andrew C. Webb, Lanny J. Rosenwasser, Steven F. Mucci, Alexander Rich, Sheldon M. Wolff, Charles A. Dinarello Proceedings of the National Academy of Sciences, USA Vol.81, pp. 7907-7911, Dezember 1984 Immunology

3 Übersicht Autor Wissensstand vor Publikation Experiment Heutiger Wissensstand Entstandene (Therapie-)Möglichkeiten Zusammenfassung

4 Charles Dinarello US-amerikanischer Mediziner Professor an der Universität von Colorado Forscher auf dem Gebiet der Cytokine (IL-1) Gründungsvater der Cytokin- Biologie U.a. Träger des Paul-Ehrlich- Preises 2010 Charles Dinarello, 2010 http://de.wikipedia.org/wiki/Charles_Dinarello

5 Wissensstand vor Publikation IL-1: sekretierte Moleküle von stimulierten mononuklearen Phagozyten (Monocyten bzw. Macrophagen) Stimulation durch z.B. LPS gramm-negativer Bakterien Vielfältige biologische IL-1 Aktivität bekannt

6 Mediator von Fieber Induktion der Synthese von Akute-Phase Proteinen (z.B. C-reaktives Protein) Steigerung der Lymphocytenproliferation und Lymphokinproduktion Induktion der Synthese von Prostaglandin E 2 und Kollagenase Wissensstand vor Publikation

7 15.000-20.000 M r Proteine mit IL-1 Aktivität Unklar ob IL-1 Aktivität auf einzelnem Molekül oder einer Familie verschiedener Substanzen beruht Keine AS-Sequenz bekannt Klonierung und Sequenzierung von cDNA noch in Anfangsphase

8 Schlüsselexperiment Kann eine IL-1 cDNA isoliert und sequenziert werden? Weist Translationsprodukt der entsprechenden mRNA IL-1 Aktivität auf?

9 Gewinnung der mRNA Isolierung und Kultivierung von humanen Monocyten Stimulierung der Zellen mit Endotoxin aus E. coli Lyse und Dichtegradientenzentrifugation Isolierung der mRNA durch Bindung an oligo(dT)-cellulose

10 Erstellung einer cDNA Bank Umschreiben der mRNA aus stimulierten Monocyten in cDNA mittels reverse Transkriptase Einbringen in Vektoren cDNA Bank

11 Klone mit stimulationsspezifischer cDNA Stimulierte Monocyten Unstimulierte Monocyten mRNA stim mRNA unstim 32 P cDNA stim 32 P cDNA unstim Klone mit stimulations- spezifischer cDNA

12 Hybrid-selektionierte mRNA Selektionierung von mRNA durch Hybridisierung mit cDNA der stimulationsspezifischen cDNA Klone Translation dieser mRNA In vitro mit Hasen-Reticulocyten Lysat Radioaktive Markierung durch [ 35 S]Methionin Immunpräzipation mit Hasen Anti-human IL-1 polyklonalem Serum

13 Hybrid-selektionierte mRNA liefert mit anti IL-1 immunpräzipierbare Proteine mit ~ 35.000 M r MarkerWasser Proteine der unselektionierten mRNA von stimulierten Monocyten Proteine der Hybrid- selektionierten mRNA

14 IL-1 Activity Assay Injektion der Hybrid-selektionierten mRNA in Xenopus Oocyten Abtrennung des Oocytenüberstands und Fraktionierung Zugabe von T-Zell Klonen Stimulation der Proliferation durch IL-1 Maß für Aktivität

15 IL-1 Activity Assay Keine Aktivität mRNA von unstimulierten Monocyten Hybrid-selektionierte mRNA durch cDNA eines Kontrollklons Aktivität mRNA von stimulierten Monocyten Hybrid-selektionierte mRNA

16 Sequenz der IL-1 Vorläufer cDNA Codiert für Protein mit 269 AS, 30.747 M r Vorläufer-Protein Start-Codon mit konservierter Sequenz (C-C-R-C-C-A-T-G-G) N-Terminus ohne für Sekretionsproteine typisches hydrophobe Signal

17 Heutiger Wissensstand Dinarello sequenzierte die cDNA von IL-1β Caspase-1 katalysiert die Prozessierung des IL- 1β Vorläufer-Proteins in seine reife sezernierte Form IL-1 Familie –Neben IL-1β noch viele weitere Vertreter bekannt, z.B IL-1α, IL-1ra(Antagonist), IL-18,… –Mit entsprechenden Rezeptoren

18 Cytokinbasierende Therapien Gezielte Blockade der biologischen Aktivität von IL-1 durch –Antikörper gegen IL-1 –Bindung an IL-1 Rezeptoren Diabetes –IL-1β schädlich für Insulin-produzierende Zellen Rheumatoide Arthritis Junevile idopathische Arthritis Chronisch-entzündliche Darmerkrankung Schuppenflechte

19 Zusammenfassung IL-1 besitzt wichtige immunologische Funktionen Werden von einem einzigen Protein vermittelt IL-1 cDNA codiert für ein Vorläufer-Protein (30,747 M r ) Prozessierung des Vorläufer-Proteins in biologisch aktive Form (15.000-20.000 M r ) Sequenzierung ermöglichte verschiedene Therapiemöglichkeiten –Besonders bei autoinflammatorischen Krankheiten

20 Quellenangabe Philip E. Auron, Andrew C. Webb, Lanny J. Rosenwasser, Steven F. Mucci, Alexander Rich, Sheldon M. Wolff, Charles A. Dinarello. 1984. Nucleotide sequence of human monocyte interleukin-1 precursor cDNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 7907-7911 Theresa T. Pizarro, Fabio Cominelli. 2007. Cloning IL-1 and the Birth of a New Era in Cytokine Biology. The Journal of Immunology. 178: 5411-5412