Kursteil D: DNA-Sequenzierung Molekularbiologische Arbeitstechniken WS 2004/05 Kursteil D: DNA-Sequenzierung Bestimmung der Nukleotidsequenz der cDNA VfNDS-A von Jennifer Wetzel

Gliederung D1: Extraktion der Plasmid-DNA Animpfen der Bakterienkulturen DNA-Gewinnung D2: Agarose-Gelelektrophorese D3: Sequenzierung der Plasmid-DNA Cycle-Sequencing Reaktionsaufreinigung Kapillarelektrophorese D4: DNA-Sequenzauswertung Vorprozessierung (Basecalling, Vector-clipping) Assembly

D1: Extraktion von Plasmid-DNA Animpfen der Bakterienkulturen (unterschiedliche E. coli-Stämme, die alle das selbe Insert tragen > cDNA VfNDS-A) Gruppe Stamm 1 Stamm 2 Stamm 3 Stamm 4 1 176-1i 176-2i 176-3 176-4i 2 176-81 176-6 176-8i 176-82 3 176-1 4 176-6a 176-6b 5 6

D1: Extraktion von Plasmid-DNA DNA-Gewinnung Angezogene Zellen abzentrifugieren und in Puffer1 (RNAse-haltig) resuspendieren RNA wird hydrolisiert Zellen durch Zugabe von Puffer2 (alkalisch) lysieren Denaturierung der chromosomalen und Plasmid-DNA Lysat mittels Puffer3 (sauer) neutralisieren und abzentrifugieren Plasmid-DNA renaturiert und gelöst, chromosomale DNA und Proteine pelletiert

D1: Extraktion von Plasmid-DNA Überstand auf QIAprep Spinsäule (Kationenaustauscher) geben und zentrifugieren gelöste Zellbestandteile ordnen sich ihrer Größe entsprechend an Säule mit PE-Puffer (1,2 M NaCl) waschen und zentrifugieren alle Moleküle < Plasmid-DNA werden ausgewaschen Säule mit Elutionspuffer EB (1,4 M NaCl) eluieren Plasmid-DNA wird aus der Säule in Eppi gewonnen

D2: Agarose-Gelelektrophorese Überprüfung der Reinheit und Konzentration der gewonnenen Plasmid-DNA Taschenbelegung: - 2 µl Aliquots der extrahierten Plasmide (mit Bromphenolblau angefärbt) - 5 µl DNA-Ladepuffer pro Gel zwei Konzentrationsstandarts bekannter Plasmid-DNA (=Marker)

D2: Agarose-Gelelektrophorese M1= 50ng-Marker M2= 100ng-Marker M3= 200ng-Marker St.1 - 4.= E. coli-Stämme 1 bis 4 siehe Tabelle

D3: Sequenzierung der DNA Cycle-Sequencing In PCR-Streifen werden pro Gruppe 8 Ansätze pipettiert - 400 ng Plasmid-DNA - 3 µl Reaktionsmix (Polymerase, dNTPs, Terminatoren) - 1 µl Primer (pro Stamm je einmal M13 universal und M13 reverse) - 1 µl Betain - add 10 µl H2O Temperatur-Profil - 60 sec 96°C - 10 sec 96°C - 60 sec 60°C - Lagerung bei 4 -10°C x 30

D3: Sequenzierung der DNA Reaktionsaufreinigung Entfernen von nicht eingebauten Terminatoren, die DNA-Sequenzierung stören Gelfiltration mit Sephadex-G50 - Sephadex auf Mikrotiterplatte mit Wasser quellen - Sequenzierreaktionsprodukte werden aufgetragen und können bei Zentrifugation mit einer zweiten Mikrotiterplatte aufgefangen werden.

D3: Sequenzierung der DNA Kapillarelektrophorese Injektion der DNA-Fragmente in die Kapillare - 9 V für 45 sec - DNA wandert ein Elektrophorese - 1500 V für 200 min (3,3 h) - DNA-Fragmente werden ihrer Molekulargröße entsprechend aufgetrennt Laseroptik am Ende der Kapillare detektiert die floureszierenden Terminatoren

D4: DNA-Sequenzauswertung Vorprozessierung primäres Basecalling (Herausrechnen der Effekte der Farbstoffe; Qualität der Sequenzierung) ScoreCard (Basensequenzlänge/Qualität [%])

D4: DNA-Sequenzauswertung sekundäres Basecalling (erneute Datenprozessierung, aber mit anderem Programm >objektiver) Darstellung der Basensequenz mit dem trev.editor (blaue Balken = Qualitätsangabe)

D4: DNA-Sequenzauswertung Vector-clipping mit VecScreen Vergleich der gewonnenen Datensequenz mit Vektor-Datenbanken in VecScreen Probleme: - (teilweise) schlechte Sequenz-Qualität - verwendeter Vektor existiert nicht in Datenbank

D4: DNA-Sequenzauswertung manuelles Vector-clipping - Suche nach Enzym-Schnittstellen GAATTC und CACCTC - Vergleich mit Angaben aus VecScreen - Markierung des Vektors Markierung des Vektorbereichs (rosa)

D4: DNA-Sequenzauswertung Assembly mit GAP4 nur Basen mit Qualität > 20 Contig 1 Contig 2 Template Display der überlappenden Stränge

D4: DNA-Sequenzauswertung Template Display der einzelnen Basen des Contigs Parameter: - Grauabstufung: Qualität der Sequenzierung dieser Base (je heller, desto besser) - grüne Markierungen: abweichende und fehlende Basen oder Basen mit Qualität < 20

D4: DNA-Sequenzauswertung Ergebnis: Nukleotidsequenz der cDNA VfNDS-A Contig 1: cggcacgaggccaatttatctcatcctcctttcacattgtcaaaatgtctaaacctgtctttcgagaatatattggtgtgaagccagactcaaaaagtttggctgattttccacaaatcacccaaacagaaaccat Contig 2: aattcggcacgagcactgatataaattccataagaaaaagaaaacaagaacttattatattgatactaagagaagtaattctccacacttttaacataatacaaaaacacatgaaaaatacaatgggtcttatttaatatttaaaggctaatgcatatagagcttatagtctttgatagatgacccatatcacgaaagatttattactgactagatatagccagttagtcatcatttggcgaggagctcttccaagacatgctctactttgaaaggttcatccccattattggagtcattagcgttccagaaaaaaacaccgggtagtgatgaggtttgtttgagttttgtgcagccaccaatgaatatatcccgtgtaattttaatatttatgtggtcaagcgggtcggtgctaaatcctggaaggactttacgaggatggtagtcatttactaccctttcatagatgtctacaaaagcatcatctgtggatacaggatttagttgattgctgaactgataatcaaccaaattgatatagtctgggtttgcattatacaaattcaggtaggaggatgcgttgttttcagatggagcaatggacaccacatggatgtttaggtcacgttcttttttgagttctgttataagttggcctatcaacctaggaaacgcctcatcccatttgatgtgctcataattaatgtcaatgccatcaatcaagttgccgctttcatttttgtatttttgaatgatcagtttgagtgactttacagcgttcgaaacccatacattttgctcagctggatcgaatggagtttcaacgccacgacctccaatgcttattaccacctttacctctggatgttttgttttcaaaattctcactttatctggaccgaagaactcatccttccaagattcctcgaaatttcccgaaccttttctgctttcgttatacttttcagtggcaaagcccaaaatgaagt